IF36.1｜冷冻电镜与质谱成像联用实现亚细胞化学定位

冷冻电镜看清结构，质谱成像识别成分，两者结合首次在近天然状态下定位细菌内污染物。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

冷冻电镜（cryo-EM）能以高空间分辨率可视化生物样品，但无法直接判断电子密度对应的化学身份。质谱成像（MS imaging）则能提供化学特异性，其中二次离子质谱（SIMS）利用聚焦离子束逐像素溅射样品并分析产生的二次离子，可同时获得元素、小分子乃至代谢物的空间分布。然而，SIMS的空间分辨率受限于初级离子束，难以在单细胞水平同时实现高分辨率和化学灵敏度。此前已有研究尝试将SIMS与电镜结合，但多局限于元素分析或需要标记，且未能在近天然冷冻条件下对未标记样品进行亚细胞尺度的分子定位。

科学问题

卡在哪里： 此前缺乏一种能够在冷冻条件下对未标记生物样品进行亚细胞尺度化学定位的方法，无法将冷冻电镜观察到的超微结构与具体分子身份直接关联。

本文要回答： 开发一种冷冻电镜与聚焦离子束二次离子质谱（cryo-EM-FIB-SIMS）联用工作流程，用于未标记生物样品的亚细胞化学定位，并验证其在细菌和真核细胞中的适用性。

技术路线

作者主要用了：cryo-EM、cryo-FIB-SIMS、cryo-LM、FIB-milled lamellae、LC-MS、TMT proteomics。

作者首先在冷冻条件下对玻璃化样品进行二维cryo-EM成像，然后将样品转移至cryo-FIB-SIMS仪器，在预先成像的区域进行质谱成像。FIB-SIMS使用聚焦镓离子束逐像素溅射样品，产生的二次离子被提取到飞行时间质谱仪中，每个像素获得一张质谱图，从而得到化学分布。通过将cryo-EM图像与SIMS图像叠加，实现结构与化学信息的关联。为验证工作流程，作者先用金纳米颗粒标记的细菌和同位素标记的细菌进行原理验证，然后对未标记的Caulobacter crescentus进行亚细胞元素分布分析，并进一步将工作流程与冷冻光镜（cryo-LM）和FIB减薄薄片（lamellae）结合，最后应用于环境污染物BPAF在细菌内的摄取和定位研究。

图 1　Fig. 1。图1展示了cryo-EM-FIB-SIMS工作流程示意图，以及金纳米颗粒标记的C. crescentus细胞的cryo-EM图像和Au信号（197 m/z）的叠加结果。金颗粒在cryo-EM中清晰可见，SIMS图像显示Au信号定位于细胞，验证了工作流程能够关联结构与化学标签。

核心亮点

亮点 1｜金纳米颗粒标记验证工作流程

作者利用SpyCatcher-SpyTag系统对Caulobacter crescentus的S层蛋白进行金纳米颗粒标记，cryo-EM图像中金颗粒清晰可见，cryo-FIB-SIMS在相同细胞上检测到Au信号（197 m/z），证实了工作流程能够关联结构信息与化学标签。此外，通过13C标记的淀粉培养Bacteroides thetaiotaomicron，检测到13C和13CN信号，表明该方法可追踪代谢物。这些结果证明cryo-EM-FIB-SIMS可用于标记或同位素示踪实验。

图 2　Fig. 2。图2显示未标记C. crescentus细胞的cryo-EM图像（低倍和高倍）以及K、Mg、Na三种元素的SIMS图像和叠加图。高倍cryo-EM图像标注了内膜、外膜、S层和储存颗粒。SIMS图像显示Na弥散分布，Mg定位于储存颗粒，K在胞质和储存颗粒中均有分布，揭示了亚细胞水平的元素差异。

亮点 2｜未标记细菌的亚细胞元素分布

对未标记的C. crescentus进行cryo-EM-FIB-SIMS成像，发现不同元素在细胞内分布不同：Na（23 m/z）弥散于胞质，Mg（24 m/z）定位于储存颗粒，K（39 m/z）在胞质和储存颗粒中均有强信号。负离子模式显示储存颗粒富含磷酸盐（PO2 63 m/z, PO3 79 m/z）。这些结果与先前关于储存颗粒中多磷酸盐反离子的报道一致，表明该方法可揭示亚细胞水平的元素和分子分布。

图 3　Fig. 3。图3展示了cryo-CLEM-FIB-SIMS工作流程，包括GFP和mRFP+金标记细胞的荧光图像、cryo-EM图像和Au信号SIMS图像。荧光颜色与金颗粒和Au信号一致，证明三种模态可关联。此外，还展示了P. aeruginosa和酵母细胞FIB薄片的cryo-EM和SIMS图像，显示K、Na、Mg在不同细胞区室的分布。

亮点 3｜与冷冻光镜和FIB薄片兼容

作者将cryo-EM-FIB-SIMS与cryo-LM结合，对混合的GFP和mRFP+金标记的C. crescentus进行成像，三种模态（荧光、金颗粒、Au信号）一致区分两种细胞，证明cryo-CLEM-FIB-SIMS工作流程可行。此外，对高压冷冻的Pseudomonas aeruginosa和酵母细胞制备的FIB薄片进行成像，获得了可识别的细胞图像，并显示K、Na在胞质富集，Mg在细胞内特定区室富集，表明该方法可拓展至真核细胞和厚样品。

图 4　Fig. 4。图4显示BPAF对C. crescentus生长的影响、生物累积分析结果和蛋白质组学数据。生长曲线显示BPAF显著延缓生长；生物累积分析显示BPAF在细胞沉淀中浓度远高于上清；蛋白质组学PCA显示BPAF暴露与对照的蛋白质组差异，热图显示外排泵蛋白上调。

亮点 4｜BPAF在细菌内的定位与储存

C. crescentus暴露于100 μM BPAF 4小时后，cryo-EM显示胞质中出现高对比度不规则聚集体和中等对比度球形储存颗粒。cryo-FIB-SIMS检测到强烈的氟信号（19 m/z）与储存颗粒共定位，而对照组无此信号。统计显示BPAF暴露细胞的储存颗粒平均直径（206.9 nm）显著大于对照组（186.4 nm，P<0.0001）。蛋白质组学显示BPAF暴露后药物外排泵（如acrB2）和调控蛋白（TipR）上调，但生物累积分析仍检测到大量BPAF在细胞内，表明BPAF被隔离在储存颗粒中，无法被外排泵有效清除。

图 5　Fig. 5。图5展示BPAF暴露后C. crescentus细胞的cryo-EM图像和SIMS图像。cryo-EM显示高对比度聚集体和储存颗粒，SIMS显示氟信号（19 m/z）与储存颗粒共定位，而PO2信号分布全细胞。对照组无氟信号。统计显示BPAF暴露细胞储存颗粒直径增大。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： cryo-EM、cryo-FIB-SIMS、cryo-LM、FIB-milled lamellae、LC-MS、TMT proteomics
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事细胞生物学、微生物学、环境毒理学及质谱成像技术开发的研究人员。

带走一句

冷冻电镜与质谱成像联用可在近天然状态下对未标记样品进行亚细胞化学定位，为研究药物、污染物等小分子在细胞内的命运提供了直接手段。