IF36.1｜Xenium空间转录组灵敏度、特异性与信号污染的系统解析

大规模基准揭示Xenium转录本溢漏普遍存在，SPLIT校正后T细胞耗竭信号得以显现。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

空间转录组技术能在组织原位实现高分辨率基因表达图谱，其中基于成像的Xenium平台因其可靠性和数据质量被广泛采用。然而，Xenium数据的特性与局限性仍缺乏系统表征。已有研究多局限于少量样本或组织芯片，且未直接比较靶向panel与5K panel在灵敏度和特异性上的差异。此外，转录本错误分配到邻近细胞（即转录本溢漏）已被多个研究指出，可导致虚假的细胞间通讯信号和混合表达谱，但缺乏大规模验证和简单有效的校正方法。

科学问题

卡在哪里： 现有Xenium研究样本量小，缺乏对靶向panel与5K panel的系统比较；转录本溢漏的普遍性和来源尚未在大规模数据中确认；现有校正方法或依赖复杂模型，或过度减少基因检出，缺乏简单可解释且保持数据完整性的方案。

本文要回答： 利用大规模Xenium数据集系统评估panel性能、分割策略和转录本溢漏，并开发一种简单有效的信号纯化方法。

技术路线

作者主要用了：Xenium空间转录组、snRNA-seq、RCTD反卷积、SPLIT校正、多重免疫荧光。

作者收集了41个乳腺癌和肺癌FFPE切片，分别用靶向panel和5K panel进行Xenium分析，并匹配部分样本的snRNA-seq和IHC数据。首先用snRNA-seq作为参考，通过RCTD对Xenium细胞进行注释并评估数据质量；然后比较不同panel的灵敏度和细胞类型分辨率；接着利用RCTD的双峰模式量化转录本溢漏，并用IHC进行正交验证；最后开发SPLIT方法，基于RCTD权重分解混合信号，并与现有校正方法和分割算法进行基准测试。

图 1　Fig. 1。图1展示了实验设计概览：不同panel和样本的细胞数、转录本数和基因数分布。可见5K panel检测到的转录本和基因总数更高，但细胞类型分离度并未相应提升。细胞类型组成在不同样本间存在差异，但技术重复间高度一致。

核心亮点

亮点 1｜靶向panel灵敏度优于5K panel

在控制基因集相同（194个共有基因）的条件下，5K panel检测到的转录本数显著低于靶向Lung panel，约60%的5K细胞因转录本数过低而未通过QC。尽管5K panel覆盖基因更多，但细胞类型分离度并未提升，其灵敏度与Chromium snRNA-seq相当。这表明5K panel以牺牲检测深度换取基因广度，而靶向panel在主要细胞类型分辨上已足够。

图 2　Fig. 2。图2比较了5K panel与靶向Lung panel在共有基因上的表现。UMAP显示两者细胞类型分离度相似，但5K panel的转录本计数明显更低。细胞类型组成在相邻切片间高度相关，且靶向panel之间的一致性高于与5K panel的一致性。

亮点 2｜转录本溢漏普遍存在且与局部细胞丰度相关

通过RCTD双峰模式估计每个细胞的次级细胞类型权重（w2），发现其与周围邻域中该细胞类型的局部丰度高度相关（余弦相似度高），表明转录本溢漏是信号污染的主要来源。恶性细胞因RNA含量高而具有最高的溢漏指数，而T细胞等RNA含量低的细胞最易受污染。多重IHC验证显示肿瘤特异性转录本出现在邻近CD8+ T细胞内，证实了物理溢漏。

图 3　Fig. 3。图3展示了转录本溢漏的证据。左图显示肿瘤特异性转录本（棕色点）出现在CD8+ T细胞（蓝色点）区域。右图示意邻域组成定义，并显示次级细胞类型权重与邻域中该类型丰度的相关性。恶性细胞的溢漏指数最高。

亮点 3｜SPLIT校正提升细胞类型纯度与分离度

SPLIT利用RCTD推断的细胞类型权重，将每个细胞的表达谱按比例分解为初级和次级成分，仅保留初级信号。与ResolVI和ovrlpy相比，SPLIT在提高细胞类型分离度（如Calinski-Harabasz指数）的同时，保留了更多细胞和基因，且不引入批次效应。SPLIT可与任何分割算法结合，与ProSeg联用效果最佳。

图 4　Fig. 4。图4比较了不同校正方法和分割策略的效果。UMAP显示SPLIT校正后细胞类型分离更清晰。定量指标表明SPLIT在提高分离度的同时保留更多细胞和基因。T细胞邻近恶性细胞时，SPLIT校正后耗竭标志物显著富集。

亮点 4｜SPLIT揭示肿瘤邻近T细胞耗竭特征

在原始数据中，邻近恶性细胞的T细胞表现出恶性/上皮基因的虚假富集，掩盖了真实的T细胞信号。SPLIT校正后，这些T细胞显示出显著的耗竭标志物上调，包括HAVCR2 (TIM-3)、CTLA4、PDCD1、LAG3和CXCL13。该结果在多种分割方法下均一致，且SPLIT的富集程度高于其他校正方法，证实了其生物学价值。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： Xenium空间转录组、snRNA-seq、RCTD反卷积、SPLIT校正、多重免疫荧光
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事空间转录组数据分析、特别是使用Xenium平台的研究人员，以及关注细胞类型注释和信号校正方法的生信开发者。

带走一句

分析Xenium数据时，应重视转录本溢漏对细胞类型注释和下游分析的影响；使用snRNA-seq参考和RCTD反卷积，结合SPLIT校正，可在不损失数据的前提下有效提升信号纯度。