周启涛生物技术工作室
基因组与遗传2025/05/07· 编译自 Nature Biotechnology

IF46.9｜进化引导设计IscB实现体内持久表观基因组编辑

NovaIscB兼顾高活性和高特异性，单AAV递送OMEGAoff实现持久基因沉默。

NovaIscB兼顾高活性和高特异性，单AAV递送OMEGAoff实现持久基因沉默。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

CRISPR-Cas9等RNA引导系统已广泛用于基因编辑，但SpCas9体积较大，限制了AAV递送，尤其当融合表观遗传效应域时。IscB是Cas9的祖先，属于OMEGA家族，体积仅约300-550 aa，且具有双核酸酶结构和大ωRNA支架，适合AAV递送和融合蛋白设计。然而，天然IscB在人类细胞中编辑效率低，且有效引导长度仅约13 nt，导致特异性差。此前研究主要聚焦于提高IscB活性，但往往以牺牲特异性为代价，难以满足体内治疗需求。

科学问题

卡在哪里： 现有IscB工程化策略（如OgeuIscB的诱变和ωRNA截短）虽提高了活性，但特异性显著下降，且有效引导长度仍短，导致脱靶风险高。同时，缺乏能同时优化活性和特异性的系统方法，且尚无基于IscB的紧凑型表观基因组编辑器能通过单AAV实现体内持久基因调控。

本文要回答： 通过进化引导的蛋白质设计，开发一种兼具高活性和高特异性、有效引导长度延长、且足够紧凑的IscB变体，并验证其作为单AAV递送的表观基因组编辑器在体内实现持久基因沉默的可行性。

技术路线

作者主要用了：同源筛选、AlphaFold2结构预测、REC结构域嫁接、RNA工程、TTISS、AAV递送。

作者首先从384个IscB和6个II-D型Cas9中筛选出在人类细胞中有活性的OrufIscB，其有效引导长度仅14-15 nt。为提高特异性，利用AlphaFold2指导将II-D型Cas9的REC结构域插入OrufIscB，获得OrufIscB-REC，有效引导长度增至19-20 nt。进一步通过REC环交换和点突变组合优化，得到NovaIscB，其有效引导长度达16 nt，特异性接近SpCas9。同时，通过结构引导截短ωRNA，将长度从225 nt缩短至166 nt，提高表达水平。最终，将失活的NovaIscB与Dnmt3A-3L和KRAB融合，构建OMEGAoff，单AAV递送后在小鼠体内实现长达6个月的PCSK9基因沉默和胆固醇降低。

Fig. 1 · 原文图，按文末许可署名使用
Fig. 1 · 原文图，按文末许可署名使用

图 1　Fig. 1。图1展示了IscB与Cas9的尺寸和结构域对比，以及筛选流程。a部分显示IscB仅约300-550 aa，远小于Cas9，且ωRNA较大。b部分概述了从同源筛选到蛋白质工程再到RNA工程的整体策略。c部分系统发育树显示具有人类细胞活性的IscB多属于含β发夹REC连接子的分支。d部分显示OrufIscB在验证实验中活性最高。e部分显示OrufIscB最佳引导长度为14-15 nt，而SpCas9为18-20 nt。

核心亮点

亮点 1｜OrufIscB：天然高活性IscB

通过大规模同源筛选，作者从384个IscB中鉴定出OrufIscB，其在人类细胞中编辑效率是OgeuIscB的5-10倍，但有效引导长度仅14-15 nt，特异性差。OrufIscB识别NTAAA TAM，在20个靶点中14个检测到indel，效率0.2%-8%。

Fig. 2 · 原文图，按文末许可署名使用
Fig. 2 · 原文图，按文末许可署名使用

图 2　Fig. 2。图2展示了OrufIscB的逐步工程化过程。a部分显示从WT OrufIscB到OrufIscB-REC再到NovaIscB的结构变化。b部分显示REC结构域插入位点与DbaCas9同源。c部分显示55个REC嫁接变体中43个对TAM远端错配更敏感。d部分显示REC环交换的三个区域。e部分显示双交换组合显著降低短引导活性。f和g部分显示NovaIscB有效引导长度增至16 nt，且在人类细胞中偏好20 nt引导。

亮点 2｜REC结构域嫁接延长有效引导长度

将II-D型Cas9的REC结构域插入OrufIscB，获得OrufIscB-REC，其有效引导长度从14 nt增至19-20 nt，在人类细胞中活性提高2-100倍，且特异性未显著下降。冷冻电镜结构显示REC结构域通过非极性相互作用稳定长达20 bp的引导-靶标异源双链。

Fig. 3 · 原文图，按文末许可署名使用
Fig. 3 · 原文图，按文末许可署名使用

图 3　Fig. 3。图3比较了WT OrufIscB、OrufIscB-REC和NovaIscB的活性和特异性。a部分显示NovaIscB在6个靶点活性提高2-100倍。b和c部分显示NovaIscB脱靶位点最少，特异性最高。d部分显示NovaIscB活性约为SpCas9的80%，但远高于其他紧凑编辑器。e部分显示NovaIscB脱靶率14.3%，与SpCas9相当，远低于enOgeuIscB和eIscB的77.6%。

亮点 3｜NovaIscB：高活性与高特异性兼备

通过REC环交换组合优化，获得NovaIscB，其有效引导长度达16 nt，在人类细胞中活性约为SpCas9的80%，但特异性与SpCas9相当（脱靶率14.3% vs 10.2%），远优于enOgeuIscB和eIscB（脱靶率77.6%）。NovaIscB比AsCas12f-YHAM活性高8.1-61.3倍。

Fig. 4 · 原文图，按文末许可署名使用
Fig. 4 · 原文图，按文末许可署名使用

图 4　Fig. 4。图4展示了ωRNA的截短工程。a部分显示ωRNA二级结构，红色为截短区域。b部分显示3'端可截短21 nt而不影响活性。c部分显示5'引导适配器发夹可截短42 nt。d和e部分显示组合截短后与OrufIscB-KRK和NovaIscB均保持活性。f部分显示最终ωRNA缩短59 nt。g部分显示截短ωRNA表达水平提高约4倍。

亮点 4｜ωRNA截短提升表达并实现AAV兼容

通过结构引导截短，将OrufIscB ωRNA从225 nt缩短至166 nt，去除5'引导适配器发夹和3'非结构区域，在人类细胞中表达水平提高约4倍，且不影响编辑活性。截短后的ωRNA与NovaIscB组合仍保持高效编辑。

Fig. 5 · 原文图，按文末许可署名使用
Fig. 5 · 原文图，按文末许可署名使用

图 5　Fig. 5。图5展示了OMEGAoff的设计和体内应用。a部分显示NovaIscB和ωRNA可包装进单AAV。b部分显示93%人类基因启动子500 bp内含NTAAA位点。c部分显示最佳融合架构为N端Dnmt3A-3L和C端KRAB。d部分显示OMEGAoff在细胞中沉默效率与CRISPRoff-V2.1相当。e部分显示RNA递送时2:1质量比最佳。f-i部分显示AAV递送OMEGAoff在小鼠体内持久降低PCSK9和胆固醇。

亮点 5｜OMEGAoff：单AAV持久表观基因组沉默

将失活的NovaIscB与Dnmt3A-3L和KRAB融合，构建OMEGAoff，单AAV8递送后在小鼠肝脏中靶向Pcsk9，实现长达6个月的PCSK9蛋白和血清胆固醇水平显著降低，且未观察到肝毒性。OMEGAoff在细胞中可沉默多种基因，效率与CRISPRoff-V2.1相当。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

  • 方法栈： 同源筛选、AlphaFold2结构预测、REC结构域嫁接、RNA工程、TTISS、AAV递送
  • 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
  • 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
  • 谁该点开原文： 从事基因编辑工具开发、表观基因组编辑或AAV基因治疗的研究人员。

带走一句

进化引导的蛋白质设计可同时优化活性和特异性，为其他RNA引导系统的工程化提供了新范式。

本页供学习交流，不替代原文，也不代表原作者、期刊或资助方立场。引用科学结论请以正式发表版本为准。 图表按 CC BY（可转载，需署名） 使用。 版权声明

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