IF36.1｜PinkyCaMP：基于mScarlet的高亮红色钙指示剂

PinkyCaMP以mScarlet为骨架，亮度、光稳定性远超现有红色GECI，且无蓝光光切换，可兼容光遗传与多色成像。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

基因编码钙指示剂（GECI）是监测神经元活动的核心工具。绿色GECI（如GCaMP系列）已发展至jGCaMP8，具备超快动力学和高灵敏度。红色GECI因波长更长、组织穿透更深、光毒性更低，且与蓝光激发的光遗传工具光谱分离，在多色成像和光遗传联用中更具优势。然而，现有红色GECI（如jRGECO1a、RCaMP3）普遍存在亮度低、光稳定性差、蓝光诱导光切换等问题，且部分存在溶酶体蓄积，限制了其在复杂实验中的应用。

科学问题

卡在哪里： 红色GECI的亮度比绿色GECI低数倍，信噪比不足；基于mApple的红色GECI（如jRGECO1a、RCaMP3）在蓝光照射下会发生光切换，导致荧光信号假性升高，干扰光遗传联用；同时，这些传感器在神经元中长期表达易出现溶酶体蓄积，影响细胞健康。

本文要回答： 开发一种基于mScarlet的新型红色钙指示剂，在亮度、光稳定性、信噪比上超越现有红色GECI，同时消除蓝光光切换和溶酶体蓄积，并验证其在多种成像模式下的性能。

技术路线

作者主要用了：定向进化、蛋白质工程、细胞培养、电生理、光纤记录、双光子成像、微型显微镜。

作者以mScarlet为骨架，通过环状重排构建cpmScarlet，并在RS20和CaM连接区引入不同长度和组成的连接肽，筛选出初始原型PinkyCaMP0.1a/b。随后进行12轮定向进化，筛选约6000个变体，获得PinkyCaMP0.9a/b/c，最终选定PinkyCaMP0.9c（即PinkyCaMP）作为最优变体。在HEK293T细胞和原代神经元中系统表征其亮度、光稳定性、光切换、动力学等性质，并与现有红色GECI及GCaMP6f对比。进一步在脑片、自由活动小鼠中验证其在光纤记录、双光子成像、微型显微镜等模式下的表现，并测试与光遗传工具及绿色GECI的多色联用能力。

图 1　Fig. 1。图1展示了PinkyCaMP的构建与筛选过程。a为结构域示意图，显示cpmScarlet中两个关键残基S28和W144的位置。b为定向进化中所有粗提蛋白的ΔF/F排序图，显示筛选出的变体响应幅度分布。c为PinkyCaMP的结构模型，标注了突变位点。d-f为纯化蛋白的光谱特性，显示激发峰568 nm、发射峰600 nm，ΔF/F达15.1，Kd为54 nM。g为HEK293T细胞中不同GECI的亮度比较，PinkyCaMP显著高于其他红色GECI。h为蓝光刺激下的光切换测试，PinkyCaMP无变化而RCaMP3明显升高。i为光漂白曲线，PinkyCaMP保留荧光比例最高。

核心亮点

亮点 1｜PinkyCaMP亮度与信噪比显著提升

在HEK293T细胞中，PinkyCaMP的基础荧光强度为701±71 a.u.，是RCaMP3（292±35 a.u.）和jRGECO1a（294±25 a.u.）的2.4倍，是jRCaMP1a（50±4 a.u.）的14倍。在原代神经元中，单次场刺激诱发的钙信号ΔF/F0为18±1%，信噪比达129±7，优于其他红色GECI。在皮层脑片中，PinkyCaMP的绝对信号强度（F0×ΔF/F0）与GCaMP6f相当，但显著高于jRGECO1a、jRCaMP1a和RCaMP3。

图 2　Fig. 2。图2展示了PinkyCaMP在原代神经元中的基本特性。a为细胞贴附记录与钙成像同步，显示自发簇状放电对应的钙信号。b为每个簇的峰电位数量分布。c为每个峰电位引起的荧光变化。d-e为场刺激诱发的钙瞬变，幅度随刺激数增加。g为单次场刺激的平均ΔF/F0为18%。h为信噪比，单次刺激达129。i-j为动力学参数，半上升时间670 ms，半衰减时间5.6 s。k-m为PinkyCaMP与stCoChR的双顺反子构建及光谱分离。n-o为光刺激诱发的电生理反应，蓝光可靠诱发动作电位，橙光仅引起微小电流。p为场刺激与光刺激诱发的钙信号比较。

亮点 2｜PinkyCaMP无蓝光光切换且光稳定性优异

在HEK293T细胞中，用470 nm蓝光（10 ms脉冲，1 mW/mm²）刺激时，PinkyCaMP的ΔF/F无增加，而RCaMP3的ΔF/F增加0.43±0.04，证实PinkyCaMP无光切换。在持续560 nm光照下，PinkyCaMP的光漂白半衰期为410.8 s，是RCaMP3（197.0 s）的2倍以上，也长于jRGECO1a（222.3 s）。在脑片实验中，额外蓝光照射后PinkyCaMP信号保持稳定，而jRGECO1a和RCaMP3出现与同步事件幅度相当的光切换信号。

图 3　Fig. 3。图3比较了PinkyCaMP与GCaMP6f、jRGECO1a、jRCaMP1a、RCaMP3在皮层脑片中的表现。a为各指示剂的代表性钙瞬变。b为基线亮度，PinkyCaMP最高。c为ΔF/F0，PinkyCaMP较大。d为绝对信号强度（F0×ΔF/F0），PinkyCaMP与GCaMP6f相当。e为衰减时间常数，PinkyCaMP较慢。f为光稳定性，PinkyCaMP漂白最少。g为蓝光照射后的信号变化，PinkyCaMP无光切换，而jRGECO1a和RCaMP3信号升高。h-k为急性海马脑片中PinkyCaMP与RCaMP3的对比，PinkyCaMP表达均匀，RCaMP3出现溶酶体蓄积。l-n为高光强下PinkyCaMP仍保持高信噪比，而RCaMP3信号迅速衰减。

亮点 3｜PinkyCaMP与光遗传工具兼容，实现全光学操控与记录

将PinkyCaMP与体靶向的CoChR（stCoChR）构建在同一双顺反子载体中，用438 nm蓝光激活stCoChR，586 nm橙光成像PinkyCaMP。在培养神经元中，蓝光脉冲可靠诱发动作电位，橙光成像光仅引起9±3 pA的微小光电流，远小于蓝光激活电流（288±65 pA）。在自由活动小鼠中，通过光纤记录结合光遗传抑制vGAT+中间神经元，观察到颗粒细胞PinkyCaMP信号在488 nm光照期间显著升高，而对照组无变化，证明该信号来自真实的神经元活动而非光切换。

图 4　Fig. 4。图4展示了PinkyCaMP在自由活动小鼠中的双色光纤记录。a为实验设计，在PrL共表达PinkyCaMP和sDarken。b为组织学验证。c为单次空气吹拂诱发的PinkyCaMP钙瞬变。d-e为平均信号和热图，显示PinkyCaMP在刺激期间升高。f为统计结果，PinkyCaMP显著升高而mCherry无变化。g-h为sDarken信号，在刺激期间下降。i为统计结果，sDarken显著下降而对照无变化。

亮点 4｜PinkyCaMP在多种成像模式下表现优异

在自由活动小鼠的前额叶皮层，PinkyCaMP光纤记录可检测到厌恶刺激（空气吹拂）诱发的钙瞬变，且与5-羟色胺生物传感器sDarken同时记录时，可观察到神经元活动增加与5-羟色胺释放减少的同步变化。在清醒头部固定小鼠的海马CA1区，双光子成像显示PinkyCaMP钙瞬变幅度为41±0.6%，事件率为3.2±0.2 min⁻¹，且在60天和90天后仍可稳定记录。在自由活动小鼠中，微型双光子显微镜也成功记录到CA1神经元的活动。

图 5　Fig. 5。图5展示了PinkyCaMP与光遗传抑制结合的光纤记录。a为实验设计，在vGAT+神经元表达stGtACR2，在颗粒细胞表达PinkyCaMP。b-c为组织学验证。d为开放场探索中的PinkyCaMP信号。e-f为488 nm光照期间与关闭期间的信号比较，stGtACR2组显著升高，eGFP组无变化。g为统计结果。h-i为cFOS染色，stGtACR2组同侧DG的cFOS阳性细胞比例显著增加。

亮点 5｜PinkyCaMP支持双色钙成像

在Gad2-Cre小鼠中，同时表达Cre依赖的GCaMP8s（标记GABA能中间神经元）和CaMKII驱动的PinkyCaMP（标记锥体神经元），用980 nm双光子激发，两个通道信号分离良好，串扰极小。在部分神经元中同时表达两种指示剂，可观察到不同神经元中两种信号的相对幅度不同，表明PinkyCaMP可与绿色GECI联合用于不同细胞群或同一细胞内的双色钙成像。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 定向进化、蛋白质工程、细胞培养、电生理、光纤记录、双光子成像、微型显微镜
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事神经科学、钙成像、光遗传学或多色成像技术开发的研究人员。

带走一句

PinkyCaMP解决了红色GECI亮度低、光切换和溶酶体蓄积的痛点，为多色成像和光遗传联用提供了可靠工具，其设计思路可借鉴用于其他荧光蛋白传感器的改造。