IF50.5｜TRiC分子伴侣系统在活细胞中的单分子动态

首次在活细胞中直接观测TRiC与PFD如何动态协作折叠新合成蛋白。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

蛋白质折叠依赖分子伴侣，其中TRiC（又称CCT）是真核生物中必需的约900 kDa双环状ATP酶复合物，通过ATP调控的底物包封机制促进折叠。TRiC与约5-10%的新生蛋白相互作用，包括肌动蛋白、微管蛋白等复杂折叠拓扑的必需蛋白。其功能高度依赖共伴侣PFD（prefoldin），后者被认为负责将客户蛋白递送至TRiC腔室。体外实验已阐明TRiC的结构与ATP酶循环，但活细胞中TRiC-PFD系统与新生多肽的动态相互作用（结合时长、频率、时序）仍属未知。细胞内的拥挤环境会深刻影响蛋白质相互作用，因此亟需在生理条件下直接观测这一系统。

科学问题

卡在哪里： 此前对TRiC-PFD系统的研究主要依赖体外重组实验，缺乏在活细胞中实时追踪其与新生蛋白动态互作的手段。TRiC与PFD在翻译过程中何时、以何种频率和时长结合新生链，以及翻译后折叠如何循环，均无直接观测数据。

本文要回答： 本文旨在建立活细胞单分子追踪方法，直接观测TRiC-PFD与新生蛋白的共翻译及翻译后相互作用，揭示其动态规律和调控机制。

技术路线

作者主要用了：CRISPR敲入、单分子追踪、选择性核糖体谱、荧光标记、TIRF显微镜。

作者利用CRISPR敲入将HaloTag插入TRiC亚基CCT4的环区，将HaloTag或SNAP标签融合至PFD4的C端，并用SNAP标记核糖体大亚基蛋白L10A，实现双色单分子追踪。通过稀疏标记策略控制荧光分子密度，结合TIRF显微镜和共定位分析，定量测量TRiC/PFD与核糖体或特定新生链（如肌动蛋白）的相互作用时长和频率。为研究特定客户蛋白，作者构建了MS2标记的肌动蛋白mRNA和SunTag标记的肌动蛋白，分别用于观测共翻译和翻译后折叠过程。

图 1　Fig. 1。图1展示TRiC/PFD与核糖体及肌动蛋白新生链的共翻译相互作用。b,c显示双色成像中TRiC/PFD与核糖体的瞬时共定位；d显示PFD3敲低显著降低TRiC-核糖体相互作用时长；e显示PFD结合频率高于TRiC。f-k利用MS2标记肌动蛋白mRNA，显示结合时长和频率随链长增加，PFD在翻译终止附近出现长寿命结合。

核心亮点

亮点 1｜PFD招募TRiC结合新生链

TRiC和PFD均以约1秒的短暂探测事件反复结合新生多肽，PFD结合频率高于TRiC。PFD3敲低导致TRiC-新生链相互作用频率降低约65%，表明PFD在招募TRiC中起关键作用。选择性核糖体谱鉴定出511个TRiC互作子和1174个PFD互作子，约80%的TRiC互作子（包括肌动蛋白和微管蛋白）也与PFD互作，且PFD的结合位点通常先于TRiC出现。

图 2　Fig. 2。图2展示翻译后折叠的观测系统与动力学。a示意SunTag拴系肌动蛋白；b,c显示TRiC/PFD与肌动蛋白-SunTag的共定位；d显示TRiC-肌动蛋白翻译后相互作用呈双组分（约0.9秒和2.4秒），而PFD-肌动蛋白也呈双组分（约0.8秒和4.9秒）；e-h显示PFD敲低消除TRiC长寿命组分；i-k显示PFD-TRiC相互作用在过表达肌动蛋白-SunTag时频率增加3倍。

亮点 2｜共翻译结合依赖链长

以β-肌动蛋白为模型，作者发现PFD和TRiC与新生链的结合频率和时长随链延长而增加。PFD对actin(1-305)的结合频率是actin(1-101)的约4倍；PFD结合时长从actin(1-368)的约1.6秒增至全长actin的约2.1秒，且全长actin出现约6秒的长寿命组分（占24%）。TRiC结合也呈链长依赖性，但增加幅度较小，且仅显示单一衰减组分（τ≈1.0秒）。

图 3　Fig. 3。图3展示G150P突变体的效应。a显示突变位点；b显示突变体翻译后TRiC结合时长显著延长（3.8秒和12.6秒组分）；c显示PFD结合寿命缩短；d显示PFD结合频率增加；e,f显示PFD-TRiC相互作用频率降低约60%。

亮点 3｜翻译后折叠循环约2.5秒

利用SunTag拴系肌动蛋白，作者观测到翻译后TRiC-肌动蛋白相互作用呈双组分动力学：约44%事件寿命约0.9秒，56%事件寿命约2.4秒。PFD敲低消除了长寿命组分，表明PFD介导TRiC与肌动蛋白的延长结合。PFD-TRiC相互作用在过表达肌动蛋白-SunTag时增加3倍，寿命约0.7秒，提示PFD在翻译后折叠中持续将肌动蛋白递送给TRiC。

图 4　Fig. 4。图4展示连续结合循环与TRiC的受限扩散。a-c显示TRiC与核糖体、共翻译新生链、翻译后肌动蛋白的on-off-on事件；d显示off状态TRiC与核糖体的距离分布；e,f显示off状态TRiC的扩散行为；g-i显示TRiC-TRiC相互作用及嘌呤霉素对长寿命组分的影响。

亮点 4｜突变体延长TRiC结合

折叠缺陷型肌动蛋白突变体G150P的翻译后TRiC结合循环比野生型长3-4倍，寿命组分分别为3.8秒（78%）和12.6秒（22%）。突变体在TRiC上持续循环直至被蛋白酶体降解（半衰期约36分钟），而野生型肌动蛋白稳定。PFD与突变体的结合频率增加但寿命缩短，且PFD-TRiC相互作用频率降低约60%，提示TRiC主要处于关闭状态，PFD无法结合。

图 5　Fig. 5。图5为模型图。a展示共翻译折叠模型：PFD和TRiC在翻译早期短暂探测，随链延长结合增强，PFD在终止前长时结合以招募TRiC；b展示翻译后折叠循环：PFD结合近全长肌动蛋白并招募TRiC，TRiC经历约2.5秒的包封循环；c展示G150P突变体在TRiC上循环时间延长；d展示TRiC在客户蛋白附近形成受限扩散的“保护区域”。

亮点 5｜TRiC在客户蛋白附近受限扩散

在连续结合循环之间，TRiC和PFD常保持在客户蛋白附近0.5-2秒，探索距离平均约0.7 μm，而非扩散至胞质。在可追踪的off状态中，30-40%的TRiC复合物发生再结合。此外，TRiC-TRiC相互作用存在约0.7秒和2秒两个寿命组分，长寿命组分在嘌呤霉素处理后减少，提示TRiC分子间可能传递客户蛋白。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CRISPR敲入、单分子追踪、选择性核糖体谱、荧光标记、TIRF显微镜
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事蛋白质稳态、单分子生物物理或翻译调控研究的科研人员。

带走一句

单分子追踪揭示分子伴侣系统在活细胞中的动态协作，提示分析蛋白质折叠时应考虑时空受限的分子行为。