IF50.5｜人肝门静脉区类组装体体外重现门周组织结构

首次实现成人肝细胞长期扩增，并组装出保留门周细胞互作与纤维化特征的类器官模型。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

慢性肝病每年导致全球超过200万人死亡，但物种差异使啮齿动物模型难以直接转化到人类治疗。人肝单细胞与空间转录组揭示了细胞异质性，但静态分析无法捕捉疾病动态过程。原代肝细胞无法体外扩增，癌细胞系存在遗传漂移，重编程肝细胞具有祖细胞特征，且现有模型均无法重现三维胆小管结构。类器官技术为模拟组织结构和功能提供了新途径，但重建成人肝脏复杂细胞互作与门周结构仍是挑战。此前已有胆管细胞类器官和肝母细胞类器官，但缺乏可长期扩增的成人肝细胞来源，且所有模型仅含上皮细胞，无法复制体内门周区的细胞组成与空间排列。

科学问题

卡在哪里： 成人肝细胞无法在体外长期扩增，导致无法获得患者特异性的肝细胞来源；同时，现有肝脏类器官模型仅由上皮细胞构成，缺乏门静脉间充质和胆管细胞，不能重现门周区的三维细胞互作与组织结构，也无法模拟胆管纤维化等复杂疾病过程。

本文要回答： 建立可长期扩增的成人肝细胞类器官，并与胆管细胞类器官和门静脉成纤维细胞组装成门周类组装体，验证其是否重现体内组织结构、基因表达和细胞互作，并用于模拟胆管纤维化。

技术路线

作者主要用了：类器官培养、RNA-seq、scRNA-seq、免疫荧光、空间成像、蛋白质组。

作者首先通过EpCAM磁珠分选从患者肝组织中分离肝细胞，利用IPA分析公共数据发现WNT和YAP信号通路在肝再生和癌症中激活，据此在培养基中添加WNT替代物和LATS1/2抑制剂TRULI，成功建立可长期传代的肝细胞类器官（h-HepOrgs）。随后优化培养基去除烟酰胺，建立分化培养基（DM）促进肝细胞成熟。接着从同一患者分离CD90+PDGFRA+门静脉成纤维细胞，与h-HepOrgs和胆管细胞类器官按生理比例在低吸附板中自组装形成门周类组装体。通过增加间充质细胞数量模拟纤维化微环境，并利用scRNA-seq和功能实验验证模型。

图 1　Fig. 1。图1展示了从患者肝组织分离肝细胞并建立h-HepOrgs的流程。IPA分析显示WNT、MAPK、FGFR2信号通路在肝再生和癌症数据集中激活，而IL-6、HIPPO、NOTCH通路失活。上游调控因子预测提示YAP和CTNNB1激活。在培养基中添加WNT替代物和TRULI后，肝细胞形成实心类器官并可连续传代，去除烟酰胺后类器官形成效率提高近10倍。

核心亮点

亮点 1｜WNT+YAP激活实现成人肝细胞长期扩增

通过对肝癌类器官和小鼠肝切除数据集的IPA分析，发现WNT和YAP信号通路在肝再生中激活。在肝母细胞培养基中添加WNT替代物和LATS1/2抑制剂TRULI，成功从28例患者（11-85岁）建立可长期传代（>10代，>3个月）的肝细胞类器官（h-HepOrgs），效率100%。去除烟酰胺后类器官形成效率提高近10倍。h-HepOrgs维持正常染色体数目，可冻存复苏，形成活体生物库。RNA-seq显示h-HepOrgs与新鲜原代肝细胞基因表达高度相关，表达HNF4A、ALB等肝细胞标志物，但AFP表达提示未完全成熟。

图 2　Fig. 2。图2对比了h-HepOrgs在扩增培养基（EM2）和分化培养基（DM）中的特征。EM2中Ki-67阳性细胞多，YAP核定位明显；DM中增殖减少，胞质/核比增加。CD13染色显示DM中胆小管变细长且分支增多，更接近体内组织。RNA-seq显示DM中成熟肝细胞标志物（ALB、APOE、CYP3A4等）上调，AFP和胆管标志物下调，且出现肝细胞分区标志物的异质性表达。

亮点 2｜分化培养基促进肝细胞成熟与胆小管网络重建

通过去除YAP激活并添加地塞米松建立分化培养基（DM），h-HepOrgs增殖减少，胞质/核比增加，CD13标记的胆小管变细长且分支增多。RNA-seq显示成熟肝细胞标志物（ALB、APOE、CYP3A4等）上调，AFP和胆管标志物下调。免疫荧光证实ZO-1定位于顶端，胆小管网络连通性接近体内组织。功能实验显示分化h-HepOrgs白蛋白分泌和CYP450活性与7天原代肝细胞相当，维拉帕米代谢能力优于1天原代肝细胞，并保留患者间代谢差异。移植到Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠可挽救致死表型。

图 3　Fig. 3。图3展示了肝细胞极性和胆小管网络的重建。E-cadherin和ZO-1染色显示DM中肝细胞形成顶端紧密连接，类似体内胆小管。CD13三维重建显示DM中胆小管网络长度和分支增加，连通性接近组织。不同患者来源的h-HepOrgs保留患者特异性的胆小管形态差异。功能实验显示DM中h-HepOrgs白蛋白分泌和CYP450活性与7天原代肝细胞相当，维拉帕米代谢能力优于1天原代肝细胞，并保留患者间差异。

亮点 3｜门周类组装体重现细胞组成与空间结构

从同一患者分离CD90+PDGFRA+门静脉成纤维细胞，与h-HepOrgs和胆管细胞类器官按1:25:100比例在低吸附板中自组装，形成门周类组装体。第6天时，胆管细胞（KRT19+）形成含腔的胆管样结构，紧邻门静脉成纤维细胞，两者嵌入肝细胞（HNF4A+）实质中，重现体内门周区结构。组装效率约80%，细胞比例与体内组织一致。scRNA-seq显示组装体细胞与体内对应细胞聚类重叠，表达经典标志物。肝细胞在组装体中上调门周标志物（SAA1、SAA2、HAMP），下调中央周标志物（CYP2E1、GLUL），功能上尿素合成和糖异生增强，药物代谢减弱，提示获得门周肝细胞身份。

图 4　Fig. 4。图4展示了门周类组装体的构建和表征。通过将h-HepOrgs、胆管细胞类器官和门静脉成纤维细胞按生理比例混合，在低吸附板中自组装形成类组装体。免疫荧光显示胆管细胞形成含腔结构，紧邻门静脉成纤维细胞，嵌入肝细胞实质中。scRNA-seq显示组装体细胞与体内对应细胞聚类重叠，肝细胞上调门周标志物，功能上尿素合成和糖异生增强。

亮点 4｜过量间充质诱导胆管纤维化样表型

将门静脉成纤维细胞数量增加20倍（1:500:100）构建纤维化样类组装体，发现胆管细胞数量增加、肝细胞数量减少，伴随肝细胞凋亡增加和胆管细胞增殖。scRNA-seq显示纤维化样组装体细胞与患者纤维化肝脏转录组高度相关，间充质和胆管细胞上调胶原和基质沉积基因，肝细胞富集TNF、IL-6、NF-κB等炎症通路，TGFβ信号在肝细胞和胆管细胞中均增强。形态上出现囊性结构，部分肝细胞表达KRT19并形成管腔，提示肝细胞向胆管转分化。这些特征与原发性硬化性胆管炎和原发性胆汁性胆管炎患者一致。

图 5　Fig. 5。图5展示了纤维化样类组装体的构建和转录组特征。增加门静脉成纤维细胞数量后，胆管细胞数量增加，肝细胞数量减少，伴随肝细胞凋亡和胆管细胞增殖。scRNA-seq显示纤维化样组装体细胞与患者纤维化肝脏转录组高度相关，间充质和胆管细胞上调基质基因，肝细胞富集炎症通路，TGFβ信号增强。形态上出现囊性结构和肝细胞向胆管转分化迹象。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 类器官培养、RNA-seq、scRNA-seq、免疫荧光、空间成像、蛋白质组
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事肝脏类器官、单细胞组学、纤维化机制或药物代谢研究的科研人员。

带走一句

该平台首次实现成人肝细胞长期扩增并组装门周类器官，为解析肝细胞分区、胆管纤维化机制及个性化药物筛选提供了可扩展的体外模型，值得生信分析者关注其单细胞数据与患者队列的整合策略。