IF50.5｜双向CRISPR筛选揭示GLIS3驱动的纤维化细胞环路

炎症相关成纤维细胞通过GLIS3整合巨噬细胞信号，驱动肠纤维化。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

慢性炎症过度刺激纤维化，导致45%的疾病相关死亡，治疗选择有限。单细胞测序已鉴定出功能特异的成纤维细胞亚群是纤维化的核心驱动者。在炎症性肠病（IBD）中，炎症相关成纤维细胞（IAFs）在克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）中扩增，表达炎症和纤维化基因特征，与抗TNF治疗耐药相关。然而，IAF活化的分子机制尚不清楚。既往研究提示IL-11是促纤维化细胞因子，但IAF如何被诱导、其关键转录调控因子是什么，以及能否靶向成纤维细胞特异性通路，仍是未解问题。

科学问题

卡在哪里： 尽管已知IAFs在IBD中扩增并与治疗耐药相关，但驱动IAF活化的上游信号和细胞内转录调控网络仍不清楚。现有免疫抑制剂不针对成纤维细胞，且缺乏成纤维细胞特异性的治疗靶点。

本文要回答： 本文旨在解析IAF活化的细胞间和细胞内分子机制，鉴定关键转录调控因子，并验证其在体内纤维化中的作用。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、空间转录组、CRISPR筛选、ChIP-seq、条件性基因敲除小鼠。

作者首先整合scRNA-seq和空间转录组数据构建IBD单细胞图谱，发现IAFs与活化巨噬细胞在空间上共定位。随后利用条件性Il11敲除小鼠和报告小鼠验证IL-11在纤维化中的功能。通过配体-受体分析和体外共培养，确定TGFβ和IL-1β是驱动IAF活化的关键信号。接着以IL11为读出，进行全基因组CRISPR敲除和激活筛选，鉴定GLIS3为关键转录因子。最后通过ChIP-seq和成纤维细胞特异性Glis3敲除小鼠验证其调控网络和体内功能。

图 1　Fig. 1。图1展示了IBD单细胞和空间图谱的构建及细胞类型丰度变化。关键点：IAFs在炎症性CD和UC中扩增，而ADAMDEC1+修复性成纤维细胞减少；IAFs特异性表达IL11、CD82、PRRX1等基因；细胞邻域分析显示IAFs与FCN1+IL1B+活化巨噬细胞在N1和N14生态位中共富集，这些生态位位于活动性或慢性结肠炎区域。

核心亮点

亮点 1｜IAFs与活化巨噬细胞形成空间共定位的细胞环路

通过整合scRNA-seq和Xenium空间转录组数据，作者发现IAFs在CD和UC炎症组织中扩增，并特异性表达IL11、CD82、PRRX1等纤维化和炎症基因。细胞邻域分析显示IAFs与FCN1+IL1B+活化巨噬细胞在N1和N14生态位中共富集，这些生态位位于活动性或慢性结肠炎区域。配体-受体分析表明活化巨噬细胞是向IAFs发送信号最强的细胞类型。在慢性DSS小鼠模型中，IL-11mNG+成纤维细胞与CD68+巨噬细胞直接相邻。体外共培养实验证实，只有促炎性巨噬细胞能诱导成纤维细胞分泌IL-11。这些结果表明活化巨噬细胞与IAFs之间存在空间上紧密偶联的细胞环路。

图 2　Fig. 2。图2通过条件性Il11敲除小鼠和报告小鼠验证IL-11在纤维化中的功能。关键点：慢性DSS处理后，Il11f/f;cre小鼠胶原沉积、羟脯氨酸和促纤维化胶原基因表达均低于Il11f/f小鼠；IL-11mNG+成纤维细胞仅在DSS处理后出现，并聚集在胶原沉积和炎症区域；scRNA-seq显示mIAFs与人IAF基因特征高度保守；配体-受体分析表明活化巨噬细胞是IAFs的最强信号来源；体外共培养证实促炎性巨噬细胞诱导成纤维细胞IL-11分泌。

亮点 2｜TGFβ和IL-1β协同驱动IAF活化

通过计算分析预测35个候选配体，筛选发现TGFβ和IL-1β（或IL-1α）能独立诱导原代结肠成纤维细胞分泌IL-11。在共培养体系中，敲除成纤维细胞上的TGFβ或IL-1β受体，或敲除巨噬细胞中的TGFB1或IL1B，均显著降低IL-11分泌。双细胞因子刺激产生协同而非叠加效应。在慢性DSS小鼠中，中和TGFβ和/或IL-1β可减少IL-11mNG+成纤维细胞数量和Il11 mRNA表达。这些结果确立TGFβ和IL-1β是IAF活化的必要且充分的驱动信号。

图 3　Fig. 3。图3展示双向CRISPR筛选鉴定GLIS3的过程。关键点：火山图显示CRISPRko和CRISPRa筛选中的富集基因；通路图显示命中基因涉及TGFβ和IL-1β信号通路；散点图显示61个共享命中基因；热图显示命中基因在人类成纤维细胞中的表达变化；时间分辨scRNA-seq显示IL11在刺激后6小时表达，GLIS3与IL11高表达簇相关；功能验证显示GLIS3敲除降低IL-11产生，激活则增加。

亮点 3｜双向CRISPR筛选鉴定GLIS3为IAF核心调控因子

以IL11为读出，作者在人类成纤维细胞中进行全基因组CRISPR敲除和激活筛选，发现61个共享命中基因，包括TGFβ和IL-1β信号通路组分。结合时间分辨scRNA-seq，GLIS3被鉴定为与IL11高表达簇最相关的转录因子（P=1.6×10^-13）。功能验证显示GLIS3敲除降低IL-11产生，激活则增加。在巨噬细胞共培养中，GLIS3敲除减弱IL-11分泌，激活则增强。这些结果证明GLIS3是整合TGFβ和IL-1β信号、驱动IL11表达的关键转录因子。

图 4　Fig. 4。图4展示GLIS3的转录调控网络。关键点：Venn图显示GLIS3敲除下调且激活上调的效应基因；ChIP-seq显示GLIS3结合峰分布，30.3%在刺激后富集增加；基因本体分析显示GLIS3调控ECM组织和炎症反应；GLIS3直接结合IL11启动子；基序分析发现FOSL1和TEAD1/TEAD3基序；ChIP-qPCR显示GLIS3敲除损害FOSL1和TEAD1结合；GLIS3签名在PROTECT队列中随疾病严重程度增加而升高。

亮点 4｜GLIS3直接调控IAF基因程序并与FOSL1/TEAD1协同

RNA-seq显示GLIS3调控超过150个效应基因，包括LIF、FAP、MMP2、PTGFR、SERPINE1和胶原基因COL6A1/COL6A3。ChIP-seq鉴定出1291个GLIS3结合峰，其中30.3%在TGFβ和IL-1β刺激后富集增加，涉及ECM组织和炎症反应通路。GLIS3直接结合IL11启动子区域。基序分析发现GLIS3峰内富集FOSL1和TEAD1/TEAD3的DNA结合基序。ChIP-qPCR证实GLIS3敲除损害FOSL1和TEAD1在共同靶基因上的结合。这些数据表明GLIS3通过协调其他转录因子来执行IAF基因程序。

图 5　Fig. 5。图5展示成纤维细胞特异性Glis3敲除对慢性DSS结肠炎的影响。关键点：Masson三色染色显示Glis3f/f;cre小鼠胶原沉积减少；羟脯氨酸和促纤维化胶原基因表达降低；结肠长度增加；组织病理评分降低；空间转录组显示Glis3敲除减少mIAFs和活化巨噬细胞，并降低中性粒细胞等免疫细胞浸润；GLIS3签名基因表达降低。

亮点 5｜GLIS3签名预测UC严重程度且成纤维细胞特异性敲除缓解结肠炎

作者整合GLIS3扰动RNA-seq、ChIP-seq和IAF特异性转录本，构建GLIS3核心签名。在PROTECT队列（>200名初治UC患儿）中，该签名评分随疾病严重程度增加而升高，且与IAF和活化巨噬细胞丰度相关。进一步精炼出50个基因签名，每个基因独立预测疾病严重程度。在慢性DSS小鼠模型中，成纤维细胞特异性Glis3敲除（Glis3f/f;cre）显著减少胶原沉积、羟脯氨酸含量和促纤维化胶原基因表达，并降低组织炎症评分、减轻体重下降、增加结肠长度。空间转录组分析显示Glis3敲除减少mIAFs和共定位的活化巨噬细胞，并降低中性粒细胞等免疫细胞浸润。这些结果证明GLIS3在体内驱动纤维化和炎症。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、空间转录组、CRISPR筛选、ChIP-seq、条件性基因敲除小鼠
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞、空间组学、CRISPR筛选或纤维化研究的生信人员和研究生。

带走一句

从单细胞空间图谱到双向CRISPR筛选，再到体内验证，展示了如何系统解析疾病相关成纤维细胞的调控网络，为靶向纤维化提供了可借鉴的范式。