IF50.5｜分泌型转位子调控N-糖基化的结构基础

冷冻电镜揭示GRP94新生链如何通过CCDC134与OST-A协同抑制自身过度糖基化。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

N-糖基化由寡糖基转移酶（OST）复合物催化，影响蛋白质折叠、降解与功能。人类基因组编码两种OST复合物：OST-A与核糖体-转位子复合物（RTC）结合，优先接触新生链；OST-B则独立作用。糖基化位点使用受序列、折叠动力学和细胞状态影响，存在显著变异性。GRP94是内质网中含量丰富的分子伴侣，通常仅在一个位点（N217）被糖基化，但在内质网应激下，多达五个“兼性”位点可被修饰，导致其降解并损害客户受体（如IGF1R、LRP6）的成熟与信号传导。前期CRISPR筛选发现CCDC134和OST-A组分参与抑制GRP94兼性位点糖基化，但其结构机制未知。

科学问题

卡在哪里： 此前研究已鉴定出CCDC134和OST-A在GRP94糖基化调控中的关键作用，但缺乏高分辨率结构信息，无法解释新生GRP94如何被特异识别、如何抑制OST-A活性、以及CCDC134如何稳定这一抑制状态。

本文要回答： 解析GRP94新生链与CCDC134、FKBP11及分泌型转位子复合物的冷冻电镜结构，阐明调控性N-糖基化的分子机制。

技术路线

作者主要用了：选择性核糖体足迹测序、单颗粒冷冻电镜、AlphaFold2建模、CRISPR-Cas9基因编辑、免疫印迹。

作者首先利用选择性核糖体足迹测序（Rfoot-seq）确定FKBP11和CCDC134在GRP94翻译过程中的结合时序。随后，从稳定表达FLAG-FKBP11的HEK293细胞中亲和纯化核糖体-转位子复合物，通过单颗粒冷冻电镜解析其结构。结合AlphaFold2多聚体预测辅助建模，并利用CRISPR-Cas9敲除细胞系和定点突变进行功能验证。

图 1　Fig. 1。图1展示GRP94结构域和六个糖基化位点，以及选择性核糖体足迹分析结果。散点图显示FKBP11和CCDC134富集的转录本与最长内腔段长度相关。位置分析显示FKBP11先于CCDC134结合，且两者在GRP94合成早期即被招募并持续至终止。

核心亮点

亮点 1｜FKBP11与CCDC134时序性招募

选择性核糖体足迹分析显示，FKBP11在GRP94新生链约161个残基时首先结合，此时pre-N段已进入内质网腔；CCDC134在约204个残基时开始结合，此时αN1螺旋也已暴露。两者结合后持续至翻译终止。GRP94是两种因子富集最显著的转录本，表明该通路对GRP94具有高度选择性。

图 2　Fig. 2。图2展示冷冻电镜密度图和模型搭建。整体密度显示核糖体、SEC61、OST-A、TRAP及新生链。放大视图显示CCDC134、FKBP11和GRP94新生链的拟合。结构比较显示新生GRP94的αN1螺旋与成熟构象相比翻转180°，结合于CCDC134表面。

亮点 2｜pre-N段作为OST-A假底物抑制剂

冷冻电镜结构显示，GRP94的pre-N段（残基25-79）深入OST-A活性位点，埋藏超过3100 Ų表面积，与STT3A、DC2和SEC61α形成广泛接触。pre-N段中的SRT基序（残基42-44）形成紧密转角，模拟受体序列结合，其中T44与STT3A的WWD基序相互作用。突变分析表明，pre-N段中大多数残基突变导致GRP94过度糖基化和降解，但不影响其分子伴侣活性。

图 3　Fig. 3。图3聚焦pre-N段与OST-A的相互作用。正交视图显示pre-N段嵌入STT3A、DC2和SEC61α之间。细节图显示pre-N段与DC2和SEC61α的β-发夹接触。突变分析显示pre-N段多个残基突变导致GRP94过度糖基化，但不影响其分子伴侣功能。

亮点 3｜CCDC134识别非天然αN1螺旋

CCDC134通过其疏水沟槽识别GRP94中翻转180°的αN1螺旋（残基82-91），该螺旋在成熟GRP94中通常结合ATP结合位点。CCDC134与GRP94的N结构域和αN1形成约1100 Ų的界面。破坏αN1或CCDC134疏水沟槽的突变均导致GRP94过度糖基化，表明该相互作用对于抑制糖基化至关重要。

图 4　Fig. 4。图4展示CCDC134与转位子及GRP94的相互作用。CCDC134通过球状结构域与FKBP11和STT3A结合，通过C端延伸与OST48、RPN2和RPN1结合。结构比较显示CCDC134结合GRP94的非天然构象，其中αN1螺旋翻转并结合CCDC134疏水沟槽。突变分析证实αN1和CCDC134沟槽对抑制糖基化至关重要。

亮点 4｜桥螺旋刚性连接两个关键界面

pre-N段与αN1之间由一段长螺旋（桥螺旋，残基63-91）连接。在桥螺旋中引入脯氨酸突变（I66P、L69P）破坏螺旋刚性，导致GRP94过度糖基化；而丙氨酸突变则无影响。这表明桥螺旋通过刚性连接OST-A和CCDC134结合位点，促进GRP94的稳定结合。

图 5　Fig. 5。图5展示转位子亚基重排。与先前cryo-ET结构相比，TRAP复合物发生15-30 Å位移，TRAPα TMD不再位于SEC61α铰链附近，KCP2占据该位置。TRAP内腔结构域与RPN2形成新界面，形成内腔前庭，可能屏蔽新生链免受OST-B作用。

亮点 5｜转位子重塑形成内腔前庭屏蔽OST-B

与CCDC134结合的转位子中，TRAP复合物发生显著位移，远离SEC61α铰链，并与RPN2形成新界面。同时，KCP2亚基被DC2的N端延伸稳定在SEC61α铰链附近。这些重排形成一个内腔前庭，由TRAP、OST-A、CCDC134和部分折叠的GRP94 N结构域围成，可能限制OST-B对下游兼性位点的接触。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 选择性核糖体足迹测序、单颗粒冷冻电镜、AlphaFold2建模、CRISPR-Cas9基因编辑、免疫印迹
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事蛋白质翻译、内质网生物学、糖基化调控或冷冻电镜结构解析的研究者。

带走一句

新生链可通过自身序列重塑转位子并招募辅助因子，实现糖基化位点的选择性调控；结构解析与功能突变结合是阐明动态翻译调控机制的有效策略。