IF36.1｜CaBLAM：高对比度生物发光钙指示剂

CaBLAM以83倍体外对比度实现无光毒性、可长时间单细胞钙成像。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

监测细胞内钙信号是理解细胞信号转导的核心。荧光基因编码钙指示剂（GECI）如GCaMP系列是活体钙成像的标准工具，但需要强激发光，导致光漂白、背景自发荧光和光毒性，限制了长期成像和自由活动动物的应用。生物发光GECI通过酶促反应产生光，无需激发光，但此前受限于低动态范围和钙亲和力不匹配，难以在生理钙浓度下实现高信噪比单细胞成像。

科学问题

卡在哪里： 现有生物发光钙指示剂（如GeNL(Ca2+)_480、CaMBI）在活细胞中对比度低（通常小于2倍），且钙亲和力过高或过低，无法在生理钙浓度范围内产生足够大的信号变化，限制了其在单细胞和亚细胞水平、长时间活体成像中的应用。

本文要回答： 开发一种高对比度、钙亲和力可调、适合活体长时间单细胞成像的生物发光钙指示剂。

技术路线

作者主要用了：定向进化、蛋白质工程、FRET、体外钙滴定、细胞培养、在体小鼠和斑马鱼成像。

作者首先通过定向进化改造Oplophorus gracilirostris荧光素酶（OLuc），获得高活性、可溶性好的SSLuc支架。随后将SSLuc拆分并插入钙传感域（RS20-CaM），通过优化C端肽序列和钙调蛋白突变，构建CaBLAM。体外钙滴定确定其亲和力和对比度，然后在细胞系和原代神经元中与GeNL(Ca2+)_480及GCaMP8s对比，最后在清醒小鼠和斑马鱼中验证活体成像性能。

图 1　Fig. 1。图1展示CaBLAM的结构设计：a为eKL9h和CaBLAM的结构模型，黄色棍状表示相对于eKAZ的突变位点，品红色为C端肽；b为传感器组件架构，显示拆分荧光素酶与钙传感域的连接；c为体外钙滴定曲线，显示CaBLAM的KD约439 nM，对比度83倍，Hill系数2.6，优于GeNL和CaMBI。

核心亮点

亮点 1｜SSLuc支架的开发

通过多轮定向进化，从eKAZ出发获得SSLuc，其体外活性比NanoLuc高数倍，且在哺乳动物细胞中不易聚集。SSLuc在Fz底物下表现最佳，但细胞内亮度受底物可用性限制。SSLuc适合插入传感域，成为构建高对比度生物发光传感器的理想支架。

图 2　Fig. 2。图2对比CaBLAM生物发光和GCaMP8s荧光在培养海马神经元中的成像。a和b为代表性成像视野和ROI，c和d为对应钙信号轨迹。CaBLAM基线低但刺激诱发ΔL/L明显，GCaMP8s基线高但ΔF/F相对较小，直观体现两种传感器的信号特性。

亮点 2｜CaBLAM的体外高对比度

CaBLAM在体外对Ca2+的KD约为439 nM，Hill系数约2.6，饱和Ca2+与零Ca2+下的发光比（绝对对比度）达83倍，远高于GeNL(Ca2+)_480（约2.3倍）和CaMBI（约1倍）。通过钙调蛋白突变（如N98I）可调节亲和力，获得KD为3 μM和280 nM的变体。

图 3　Fig. 3。图3定量比较CaBLAM和GCaMP8s对1、5、40脉冲电刺激的响应。a和b为平均时间锁定轨迹，c显示CaBLAM的ΔL/L峰值显著高于GCaMP8s的ΔF/F，d和e显示CaBLAM响应更慢，f显示GCaMP8s的峰值SNR更高。表明CaBLAM在对比度上占优但动力学较慢。

亮点 3｜细胞中对比度显著优于GeNL

在U2OS细胞中，CaBLAM对离子霉素刺激的对比度比GeNL(Ca2+)_480高5.4倍；在HeLa细胞中，组胺诱导的振荡幅度大3.3倍；在原代大鼠皮层神经元中，KCl去极化引起的生物发光增加约20倍，而GeNL(Ca2+)_480仅约4倍。CaBLAM的低基线发光和高Hill系数是其优势。

图 4　Fig. 4。图4展示清醒小鼠在体成像结果。a为实验装置，b为两种成像配置，c为平均投影图像，d为CaBLAM单细胞活动轨迹，e-j为响应细胞比例、波形、潜伏期和SNR比较，k和l为外周注射CFz后的群体反应。CaBLAM单次试验SNR显著高于GCaMP6s，且基线更稳定。

亮点 4｜与GCaMP8s的神经元成像对比

在大鼠海马神经元中，CaBLAM在10 Hz成像下可检测单次动作电位引起的钙信号，ΔL/L变化大于GCaMP8s的ΔF/F（1次刺激P=1.1×10^-10）。但CaBLAM响应动力学较慢（峰值时间约700 ms vs GCaMP8s约100 ms），且GCaMP8s的峰值SNR更高。CaBLAM在4.6 μM Fz下响应更快更大。

图 5　Fig. 5。图5展示斑马鱼中CaBLAM的应用。a为星形胶质细胞表达，b-g为尾部运动与生物发光信号的关系，h-k为不同驱动系的响应动力学，l-n为低端相机成像结果，o-q为增强型相机高速成像和kymograph。证明CaBLAM可在清醒斑马鱼中监测神经元和胶质细胞的钙活动。

亮点 5｜清醒小鼠单细胞SNR优于GCaMP6s

在NDNF-Cre小鼠中，CaBLAM在无激发光条件下实现单细胞分辨率成像，触觉刺激诱发的单次试验SNR显著高于GCaMP6s（P=1.89×10^-5），主要由于CaBLAM基线波动更小。CaBLAM响应起始潜伏期较GCaMP6s晚（中位数1 s vs 0.45 s）。外周注射CFz后，CaBLAM在2 Hz和10 Hz下均能检测到快速起始的群体反应。

亮点 6｜长时间稳定成像与斑马鱼应用

CaBLAM在麻醉小鼠中单次给予FFz后，可稳定成像超过5小时，SNR不随时间显著下降。在斑马鱼中，CaBLAM在神经元和星形胶质细胞中表达，可检测尾部大幅运动引起的钙信号，不同驱动系表现出不同动力学。使用非制冷相机或增强型相机均可实现空间分辨成像。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 定向进化、蛋白质工程、FRET、体外钙滴定、细胞培养、在体小鼠和斑马鱼成像
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事神经科学、钙成像、生物传感器开发或需要长时间活体成像的研究人员。

带走一句

CaBLAM证明通过优化荧光素酶支架和钙传感域，生物发光钙指示剂可以达到与荧光GECI相当的活体单细胞成像性能，且无光毒性，适合长时间或自由活动实验。