IF50.5｜临床样本中肿瘤反应性异型CD8 T细胞簇的分离与功能解析

从黑色素瘤转移灶中直接分离的CD8 T细胞-肿瘤/APC异型簇，富集肿瘤反应性T细胞，杀伤活性提升9倍。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

肿瘤微环境中免疫细胞与癌细胞的空间邻近性与免疫治疗响应相关。例如，黑色素瘤中CD8+ TILs与肿瘤细胞距离<20 μm与免疫检查点抑制剂响应相关。T细胞通过TCR识别抗原后形成免疫突触，直接接触是杀伤的前提。单细胞测序揭示了TME的复杂性，但通常只分析单细胞，忽略了物理相互作用的细胞簇。已有研究利用PIC-seq等方法分析相互作用的细胞，发现特定基因特征。然而，从临床样本中直接分离并功能验证异型T细胞簇尚未实现。

科学问题

卡在哪里： 此前研究多基于单细胞悬液，物理上相互作用的细胞簇在流式分选中常被排除或解离，导致肿瘤反应性T细胞被低估或丢失。缺乏从临床样本中直接分离异型T细胞簇并验证其功能的方法。

本文要回答： 从临床黑色素瘤样本中分离CD8+ T细胞与肿瘤细胞/APC形成的异型簇，并解析其转录组、TCR克隆型和抗肿瘤功能。

技术路线

作者主要用了：流式分选、成像流式、scRNA-seq、scTCR-seq、REP扩增、PDX模型。

作者首先在体外共培养模型中证实抗原特异性T细胞优先与肿瘤细胞形成异型簇，并具有更强的肿瘤控制能力。随后，对21例黑色素瘤转移灶进行短时酶消化，利用流式分选分离CD8+ T细胞-肿瘤细胞簇和CD8+ T细胞-APC簇，并通过成像流式和多重免疫荧光验证。对分选后的细胞进行scRNA-seq和scTCR-seq，比较簇来源与单细胞来源T细胞的转录状态、TCR克隆型和肿瘤反应性特征。最后，将簇来源T细胞经REP扩增后，在体外杀伤实验和PDX小鼠模型中验证其抗肿瘤活性。

图 1　Fig. 1。图1展示体外共培养中异型簇的形成和功能。a-b显示流式和成像流式检测到双阳性细胞簇及免疫突触标志物重定位。c显示多种癌细胞系均可形成簇。d-f竞争实验显示MART-1特异性T细胞在簇中富集，即使仅占1%也富集11倍。g显示跨癌种特异性T细胞富集。h-i显示簇来源T细胞在NSG小鼠中显著抑制肿瘤生长，而单细胞来源T细胞无效。

核心亮点

亮点 1｜抗原特异性T细胞竞争性形成异型簇

在体外共培养中，MART-1特异性T细胞与非特异性T细胞混合后，特异性T细胞在异型簇中富集2.7倍，即使仅占1%也能富集11倍。簇中T细胞CD69表达上调，表明抗原识别驱动簇形成。将簇来源T细胞经REP扩增后过继转移至荷瘤NSG小鼠，可显著抑制肿瘤生长，而单细胞来源T细胞无此效果。这提示异型簇富集了功能性肿瘤反应性T细胞。

图 2　Fig. 2。图2展示临床样本中异型簇的分离和验证。a-b显示消化和流式分选策略，识别CD8+ T细胞-肿瘤细胞簇和CD8+ T细胞-APC簇。c显示所有21例患者均检测到两种簇。d-e成像流式证实簇中免疫突触标志物重定位。f显示CD4+ T细胞簇也存在。g多重免疫荧光显示CD8+ T细胞、肿瘤细胞和APC在<10 μm内共定位。

亮点 2｜临床样本中分离到异型CD8 T细胞簇

从21/21例黑色素瘤转移灶中均分离到CD8+ T细胞-肿瘤细胞簇和CD8+ T细胞-APC簇。成像流式显示簇中免疫突触标志物（HLA-ABC、CD58、CD11c）在细胞接触界面显著重定位。多重免疫荧光证实了CD8+ T细胞、肿瘤细胞和APC在<10 μm范围内的共定位。簇的比例与T细胞浸润程度相关，且冻融不影响簇的检测。

图 3　Fig. 3。图3展示scRNA-seq和scTCR-seq分析结果。a显示分选和测序流程。b UMAP显示14个CD8+ T细胞状态，簇来源T细胞富集Tex和Tex/Tprol状态。c显示簇来源T细胞TCR克隆性更高。d显示肿瘤反应性签名在簇来源T细胞中高表达。e显示簇签名可预测TIL治疗响应。f-g显示TCR匹配T细胞与APC结合后耗竭更重，且配体-受体互作差异。h-j显示特定肿瘤细胞和APC亚群在簇中富集。

亮点 3｜簇来源T细胞富集耗竭和肿瘤反应性特征

scRNA-seq分析5例患者，鉴定出14个CD8+ T细胞状态。与单细胞相比，簇来源T细胞显著富集耗竭（Tex）和增殖性耗竭（Tex/Tprol）状态，而单细胞富集naive和效应记忆状态。簇来源T细胞TCR克隆性更高，提示克隆扩增。肿瘤反应性基因签名在簇来源T细胞中高表达，而病毒反应性签名在单细胞中高表达。基于簇来源T细胞构建的30基因和100基因签名，可预测外部数据集中TIL治疗响应。

图 4　Fig. 4。图4展示簇来源T细胞的功能验证。a显示实验设计：分选后REP扩增，再与自体肿瘤共培养或过继转移至PDX小鼠。b-c显示簇来源T细胞产生更多IFNγ和TNF。d显示簇来源T细胞杀伤活性平均提高9倍。e-f显示PDX模型中簇来源T细胞浸润和活化增加。g显示簇来源T细胞显著延迟肿瘤生长。h-i显示单细胞分选丢失大部分簇，且簇来源T细胞杀伤活性优于CD39+单细胞分选。

亮点 4｜TCR匹配T细胞与APC结合后耗竭更重

利用scTCR-seq匹配相同TCR克隆型，发现与APC结合的T细胞比与肿瘤细胞结合的T细胞表达更高的耗竭基因签名。配体-受体分析显示，T细胞-APC簇中富集CD80/CD86-CTLA4/CD28和PD-L1/2-PD-1等共调节互作，而T细胞-肿瘤细胞簇中富集CD58-CD2和ICAM1-ITGAL等黏附互作。这表明APC可能提供更强的共抑制信号，导致T细胞更深度耗竭。

亮点 5｜簇中富集特定肿瘤细胞和APC亚群

肿瘤细胞中，抗原呈递和干扰素信号相关亚群在簇中富集，且高表达CCL5、CXCL9/10等T细胞趋化因子和PD-L1。APC中，C1qhigh脂质相关和炎症性巨噬细胞、浆细胞样DC和成熟DC（mregDC）以及浆细胞在簇中富集。这些亚群高表达CCL4、CXCL9/10和PD-L1等配体，提示它们主动招募并调节T细胞。

亮点 6｜簇来源T细胞杀伤活性增强且富含干细胞样耗竭状态

经REP扩增后，簇来源T细胞对自体肿瘤的杀伤活性平均提高9倍（肿瘤簇8倍，APC簇9倍），且IFNγ和TNF产生增加。在PDX模型中，簇来源T细胞过继转移后肿瘤生长显著延迟，T细胞浸润和活化标志（CD137、PD-1、CD39）上调。与CD39+单细胞分选相比，簇来源T细胞富集TCF7+干细胞样耗竭状态，该状态与TIL治疗响应相关。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 流式分选、成像流式、scRNA-seq、scTCR-seq、REP扩增、PDX模型
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 做肿瘤免疫、单细胞分析、TIL治疗或流式分选的研究者。

带走一句

别再把异型细胞簇当垃圾丢掉——它们富集了肿瘤反应性T细胞，且富含TCF7+干细胞样耗竭状态，是TIL治疗的优质来源。