IF50.5｜成花素激活复合体通过多界面组装形成

FT 并非仅靠 14-3-3 招募，而是通过 DNA-FD-14-3-3 复合体上的两个界面被招募。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

成花素 FT 在叶片中合成，经韧皮部运输至茎尖分生组织（SAM）诱导开花。在 SAM 中，14-3-3 蛋白被认为作为 FT 的受体，介导 FT 与 bZIP 转录因子 FD 的间接互作，形成成花素激活复合体（FAC），激活开花基因转录。14-3-3 蛋白在真核生物中高度保守，与磷酸化残基结合，近期研究提示其可能作为类伴侣蛋白抑制客户蛋白的相分离。然而，14-3-3 在 FAC 组装中的具体作用机制，以及 FT 在 SAM 中相对于其他 FAC 组分的时空积累模式，仍不清楚。

科学问题

卡在哪里： 此前模型认为 FT 直接被 14-3-3 蛋白招募，但体外实验显示 FT 与拟南芥 14-3-3 蛋白互作微弱或不稳定，且 FD 的磷酸化位点及 14-3-3 对 FD 功能的调控机制均未在体内得到验证。

本文要回答： 阐明 FAC 组装的生化机制，揭示 14-3-3 蛋白在复合体中的多重功能，并解析 FT 在 SAM 和花原基中的时空分布。

技术路线

作者主要用了：共聚焦成像、RNAscope、IP-MS、凝胶过滤、EMSA、ChIP-qPCR、AlphaFold 建模。

作者首先利用 gFT::FT-mVenus 和 gFD::mScarlet1-FD 转基因植株，通过共聚焦成像和单细胞核定量，比较 FT 与 FD 在 SAM 中的时空共定位。随后利用 RNAscope 同时检测 FT、FD 和 TFL1 的 mRNA 在花原基中的分布。在生化层面，通过凝胶过滤和 EMSA 在体外重建 FAC 组装过程，结合 AlphaFold 结构预测设计突变体，验证 FT 的 C 末端尾巴与 DNA 的直接互作。进一步通过 IP-MS 鉴定 FD 的磷酸化位点，并在体内外分析 14-3-3 对 FD 相分离和 DNA 结合的影响。

图 1　Fig. 1。图1展示了 FT-mVenus 和 mScarlet1-FD 在 SAM 中的共定位。10 LD 时 FT 信号主要在维管束末端，11-13 LD 时 FT 出现在肋区、组织中心和周边区，与 FD 共定位的细胞核数量增多，且 FT 荧光强度在 FD 阳性核中更高。

核心亮点

亮点 1｜FT 与 FD 在花原基中共转录

通过 gFT::FT-mVenus 和 gFD::mScarlet1-FD 转基因植株的共聚焦成像，发现 FT 蛋白在 11-13 LD 时出现在 SAM 的肋区、组织中心和周边区，与 FD 蛋白共定位于细胞核。RNAscope 显示，在 14 LD 时 FT 和 FD mRNA 在第一个花原基的近轴侧共表达，随后 FT mRNA 定位于花原基与抑制苞片之间的边界，位于 AP1 表达域下方。定量分析表明 FT mRNA 在 14 LD 和 16 LD 时在原基区域达到峰值，而 TFL1 mRNA 主要积累在 SAM 和腋生分生组织。

图 2　Fig. 2。图2通过 RNAscope 显示 FT、FD 和 TFL1 mRNA 在花原基中的时空分布。10 LD 时 FT mRNA 未检测到，13 LD 时 FT 出现在茎生叶近轴侧，14 LD 时 FT 与 FD 在第一个花原基近轴侧共表达，16 LD 时 FT mRNA 定位于原基与抑制苞片边界，位于 AP1 表达域下方。

亮点 2｜DNA 结合的 FD-14-3-3 复合体招募 FT

体外凝胶过滤实验显示，FT 不能直接与 14-3-3 蛋白或 FD-14-3-3 复合体结合，但在加入含 SEP3 启动子片段的 DNA 后，FT 被招募到 DNA-FD-14-3-3 复合体上。AlphaFold 建模预测 FT 的 C 末端无序尾巴（interface 1）直接与 DNA 接触，突变 R166A/R173A/R174A（Mu1）完全废除体外招募。此外，FT 与 14-3-3 的互作界面（interface 2）突变 F101A（Mu2）也削弱招募。在体内，FT(Mu1) 和 FT(Mu2) 与 FD 的共免疫沉淀效率降低，ChIP-qPCR 显示它们与 SEP3 启动子的结合减少。转基因互补实验表明 FT(Mu1) 完全不能回补 ft-10 晚花表型，FT(Mu2) 部分回补。

图 3　Fig. 3。图3展示体外重建 FAC 组装。凝胶过滤显示 FT 不能直接结合 14-3-3 或 FD-14-3-3，但在 DNA 存在下被招募。AlphaFold 模型显示 FT C 末端尾巴与 DNA 接触。突变 FT 的 interface 1（Mu1）或 interface 2（Mu2）均削弱招募。

亮点 3｜14-3-3 抑制 FD 相分离以促进 DNA 结合

质谱鉴定到 FD 在 T282 位点的磷酸化。在 fd-3 突变体中表达 gFD::mVenus-FD(T282A)（不能结合 14-3-3）导致 FD 在细胞核内形成大的 puncta，而野生型 FD 均匀分布。体外液滴形成实验显示，mScarlet1-FD(T282E) 和 mScarlet1-FD(T282A) 在 PEG8000 和 150 mM NaCl 条件下均形成动态液滴，但加入 GRF7 后，T282E 液滴被显著抑制，而 T282A 液滴不受影响。ChIP-qPCR 显示 FD(T282A) 对靶基因的结合减弱，靶基因表达下调。

图 4　Fig. 4。图4展示 14-3-3 对 FD 相分离的调控。gFD::mVenus-FD(T282A) 在核内形成大 puncta，而野生型 FD 均匀分布。体外液滴实验显示 GRF7 抑制 FD(T282E) 液滴形成，但不影响 FD(T282A)。ChIP-qPCR 显示 FD(T282A) 对靶基因结合减弱。

亮点 4｜14-3-3 促进 FD 二聚化并增强 DNA 结合

SEC-MALS 显示 MBP-FDc(T282E) 在低浓度形成二聚体，高浓度形成四聚体或八聚体。加入 GRF7 后，FDc(T282E) 寡聚体解离为二聚体。AlphaFold 预测 FDc 的二聚化界面，设计突变破坏二聚化（Mu3、Mu4、Mu5）导致 FD 功能受损，而弱突变 Mu2 和 Mu6 可被 14-3-3 克服。EMSA 显示 GRF7 增强 FDc(T282E) 的 DNA 结合。此外，14-3-3 结合可能限制 FD C 末端 C13 区域的灵活性，从而增强 DNA 结合。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 共聚焦成像、RNAscope、IP-MS、凝胶过滤、EMSA、ChIP-qPCR、AlphaFold 建模
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 研究植物开花调控、转录因子复合体组装或相分离与基因表达关系的科研人员。

带走一句

FAC 组装依赖 DNA 结合的 FD-14-3-3 复合体，FT 的 C 末端尾巴直接接触 DNA；14-3-3 通过抑制 FD 相分离和促进二聚化来增强其 DNA 结合能力。