IF50.5｜纳米抗体鸡尾酒：一种重组抗蛇毒血清覆盖非洲18种眼镜蛇科毒蛇

仅用8个纳米抗体，实现非洲大陆眼镜蛇科毒蛇致死性与局部组织坏死的广谱中和。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

蛇咬伤是撒哈拉以南非洲被忽视的热带病，每年估计超过30万例蛇咬伤，导致超过7000人死亡和10000例截肢。目前唯一特异性治疗是来自超免疫动物血浆的抗蛇毒血清，但存在批次差异、成本高、物种覆盖有限、可能引起免疫不良反应等缺点，且对局部组织损伤效果差。非洲最具医学意义的18种眼镜蛇科毒蛇分属Dendroaspis（曼巴）、Hemachatus（rinkhals）和Naja（眼镜蛇）三个属，其毒液成分复杂，包含三指毒素（3FTx）、磷脂酶A2（PLA2）和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂（KUN）等多个蛋白家族，临床表现从神经毒性到局部组织坏死差异巨大。

科学问题

卡在哪里： 重组单克隆抗体或纳米抗体虽已证明能中和单一或少数几种毒液，但尚未有重组抗蛇毒血清能覆盖一个地区所有医学相关蛇种。毒液成分的复杂性使得普遍认为需要大量抗体才能中和所有医学相关毒素，这一观点限制了重组抗蛇毒血清的开发。

本文要回答： 本文旨在开发一种基于纳米抗体的重组抗蛇毒血清，能够中和撒哈拉以南非洲所有18种最医学相关的眼镜蛇科毒蛇的致死性和局部组织坏死。

技术路线

作者主要用了：蛋白质组学、噬菌体展示、DELFIA、BLI、膜片钳、细胞毒性实验、X射线晶体学、冷冻电镜、AlphaFold 3、小鼠体内实验。

作者首先对18种毒蛇毒液进行蛋白质组学分析，确定关键毒素家族及亚家族，然后免疫羊驼和美洲驼构建噬菌体展示文库，通过交叉淘选策略筛选出广谱高亲和力纳米抗体。对筛选出的纳米抗体进行体外结合和中和实验，选择8个覆盖7个毒素亚家族的纳米抗体组成实验性重组抗蛇毒血清。随后在小鼠模型中通过预孵育和救援实验评估其预防致死性和减少皮肤坏死的能力，并与市售多价抗蛇毒血清Inoserp PAN-AFRICA进行比较。

图 1　Fig. 1。图1展示了非洲18种最医学相关眼镜蛇科毒蛇的地理分布、蛇咬伤发生率、死亡率和发病率，以及重组抗蛇毒血清的开发流程：免疫羊驼和美洲驼、构建噬菌体展示文库、筛选广谱高亲和力纳米抗体、体外和体内表征、最终组合8个纳米抗体成为实验性重组抗蛇毒血清。

核心亮点

亮点 1｜8个纳米抗体覆盖7个毒素亚家族

通过免疫18种毒蛇毒液、噬菌体展示筛选和体外功能验证，最终选定8个纳米抗体，分别靶向短链神经毒素（sNTx）、长链神经毒素（lNTx）、细胞毒素（CTx）、孤儿组XI（Og XI）、aminergic毒素（AgTx）、Kunitz型蛋白酶抑制剂（KUN）和磷脂酶A2（PLA2）。这些纳米抗体在体外表现出低纳摩尔亲和力（Kd）和缓慢解离速率（koff < 5.5 × 10^-4 s^-1），并能完全抑制神经毒性（膜片钳实验）和细胞毒性（细胞活力实验）。

图 2　Fig. 2。图2展示了纳米抗体的筛选和结合特性。a：超过3000个VHH克隆对同源毒素的结合筛选，约60%结合。b：21个VHH对代表毒素的剂量-反应结合曲线，EC50在1-15 nM。c：15个交叉反应VHH对多种毒液组分和毒素的等亲和力图，显示低纳摩尔Kd和慢解离速率。

亮点 2｜预孵育实验预防17种毒蛇致死性

在小鼠预孵育实验中，将3倍LD50的毒液与固定剂量的重组抗蛇毒血清混合后静脉注射，结果显示该抗蛇毒血清能预防18种毒蛇中17种的致死性，仅对Dendroaspis angusticeps无效。对于D. polylepis，观察到短暂严重嗜睡后恢复，推测可能由毒液中腺苷或乙酰胆碱等小分子引起。对于D. angusticeps，抗蛇毒血清延长了存活时间至3-6小时，但未能完全保护，可能因为毒液中富含muscarinic toxins、fasciculins等未被靶向的毒素。

图 3　Fig. 3。图3展示了纳米抗体的体外中和活性。a：膜片钳实验显示抗sNTx和抗lNTx纳米抗体能完全抑制神经毒素对肌肉型nAChR电流的阻断，在1:1摩尔比下即可实现。b：细胞活力实验显示抗CTx纳米抗体VHH1 a-CTx和VHH4 a-CTx对7种Afronaja毒液的细胞毒性有75-95%和50-85%的保护，而抗PLA2纳米抗体VHH20 a-PLA2几乎无保护。c：酶活实验显示VHH20 a-PLA2能完全抑制Afronaja毒液的PLA2活性，但对H. haemachatus毒液无效。

亮点 3｜救援模型优于市售抗蛇毒血清

在更接近真实蛇咬的救援模型中，先皮下注射3倍LD50毒液，5分钟后静脉注射重组抗蛇毒血清。结果显示，该抗蛇毒血清完全预防了N. haje、N. annulifera、N. nivea、N. senegalensis、N. nubiae和H. haemachatus的致死性，对D. viridis和N. melanoleuca也有部分保护。相比之下，市售Inoserp PAN-AFRICA抗蛇毒血清对所有测试毒液仅显示部分中和，且对N. melanoleuca仅延长死亡时间。

图 4　Fig. 4。图4展示了两个VHH-毒素复合物的晶体结构。a：VHH1 a-CTx（浅蓝）与cardiotoxin（鲑鱼色）的双表位结合，放大视图显示氢键、π-π和π-CH相互作用及范德华力。b：VHH5 a-sNTx（浅蓝）与short neurotoxin 1（紫色）的复合物。结构下方的序列比对显示VHHs识别的表位残基在靶毒素中高度保守。

亮点 4｜显著减少皮肤坏死

针对非洲喷毒眼镜蛇（Afronaja和Hemachatus）引起的局部组织坏死，作者测试了抗CTx和抗PLA2纳米抗体混合物。在预孵育模型中，该混合物显著减少了N. mossambica、N. nigricollis和H. haemachatus毒液引起的皮肤坏死面积，且大多数小鼠完全无病变。在救援模型中（皮内注射毒液后15分钟局部给予纳米抗体），也显著减少了坏死面积。当重组抗蛇毒血清（含8个纳米抗体）静脉注射时，对N. nigricollis毒液引起的坏死有显著减少，而Inoserp PAN-AFRICA抗蛇毒血清无显著效果。

图 5　Fig. 5。图5展示了重组抗蛇毒血清的体内保护效果。a：预孵育实验中，重组抗蛇毒血清预防了18种毒蛇中17种的致死性。b：救援实验中，重组抗蛇毒血清完全预防了6种毒蛇的致死性，对D. viridis和N. melanoleuca部分保护，而Inoserp PAN-AFRICA抗蛇毒血清仅部分中和。c：预孵育和局部救援模型中，抗CTx和抗PLA2纳米抗体混合物显著减少皮肤坏死面积。d：静脉注射重组抗蛇毒血清对N. nigricollis毒液引起的皮肤坏死有显著减少，而Inoserp PAN-AFRICA无显著效果。

亮点 5｜结构基础揭示广谱中和机制

通过X射线晶体学解析了VHH1 a-CTx与cardiotoxin、VHH5 a-sNTx与short neurotoxin 1的复合物结构，发现VHH1 a-CTx是双表位结合，可能解释其优于VHH4 a-CTx的中和效果。冷冻电镜和AlphaFold 3预测了其他VHH-毒素复合物，显示VHHs主要结合毒素上保守的表位残基，这可能是其广谱中和活性的分子基础。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 蛋白质组学、噬菌体展示、DELFIA、BLI、膜片钳、细胞毒性实验、X射线晶体学、冷冻电镜、AlphaFold 3、小鼠体内实验
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事抗体工程、毒理学、重组药物开发或蛋白质组学驱动的治疗设计的研究者。

带走一句

蛋白质组学指导的毒素靶点选择与噬菌体展示筛选广谱纳米抗体相结合，可以用极少数的抗体分子实现复杂毒液的中和，为其他复杂抗原系统的抗体开发提供了范式。