IF36.1｜PHLOWER：用霍奇拉普拉斯分解推断多分支分化轨迹

PHLOWER利用单纯复形上的调和分量，从多模态单细胞数据中重建复杂分化树，并预测关键转录因子。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

细胞分化是发育和疾病中的核心过程，转录因子通过结合开放染色质区域调控基因表达，从而协调分化。多模态单细胞测序可同时测量转录组和染色质开放性，为解析分化中的调控网络提供了丰富数据。然而，实验方法会解离细胞，无法直接追踪单个细胞的分化路径。因此，计算轨迹推断成为关键工具，它通过探索细胞空间的非线性嵌入来重建分化树。现有方法多用于小规模树结构（3-9个分支），且缺乏对复杂多分支轨迹的系统评估。此外，多模态数据需要联合嵌入，进一步增加了计算挑战。

科学问题

卡在哪里： 当前轨迹推断方法主要针对小规模分化树，缺乏对复杂、多分支轨迹的可扩展性评估。同时，多模态单细胞数据（如RNA+ATAC）的联合嵌入和轨迹推断仍是一个开放问题，尚无方法能有效利用多模态信息推断复杂分化树并识别分支特异性调控因子。

本文要回答： 本文旨在开发一种能够从单细胞多模态数据中推断复杂多分支分化树的方法，并利用该方法识别调控特定分支（包括脱靶细胞）的关键转录因子。

技术路线

作者主要用了：单纯复形、霍奇拉普拉斯分解、调和特征向量、轨迹嵌入、多模态整合、空间转录组。

PHLOWER首先将单细胞数据表示为图，利用图拉普拉斯估计伪时间并识别祖细胞和终末细胞。然后通过Delaunay三角剖分构建单纯复形，并连接高伪时间与低伪时间细胞以形成代表分化轨迹的“洞”。接着对单纯复形上的边流空间进行霍奇分解，提取调和特征向量，将细胞分化事件和路径嵌入到调和空间中。在该空间中，通过聚类识别主要轨迹，并利用累积轨迹嵌入重建分化树。最后，结合基因表达和TF活性分析，识别分支特异性调控因子。该方法在模拟数据和真实scRNA-seq数据上进行了基准测试，并应用于肾脏类器官的多模态和空间数据。

图 1　Fig. 1。图1展示了PHLOWER的核心流程：从多模态数据构建图表示和嵌入，利用图拉普拉斯分解和随机游走估计伪时间，识别祖细胞（MEFs）和终末细胞；然后连接高低伪时间细胞，通过Delaunay三角剖分构建单纯复形；最后通过霍奇分解获得边嵌入和轨迹嵌入，用于推断分化树。示例展示了MEF向神经元或肌细胞分化的简单树。

核心亮点

亮点 1｜基准测试中全面领先

在模拟数据（10个数据集，5-18个分支）和33个Dynverse真实scRNA-seq数据集上，PHLOWER在树拓扑恢复（HIM分数）、细胞在分支内的定位（相关性）、细胞分配到分支（F1 branches）和分支点（F1 milestones）以及综合准确率方面均获得最高平均分。在模拟数据中，PHLOWER的HIM分数和F1 branches显著优于PAGA、Monocle3等方法；在真实数据中，PHLOWER在结构相似性和细胞定位上均排名第一。此外，PHLOWER在胰腺祖细胞（3,696细胞）和神经发生（18,213细胞）数据集上成功恢复了主要分支，而Monocle3遗漏了部分分支或产生不连通树，PAGA则出现假阳性分支。

图 2　Fig. 2。图2展示了PHLOWER与12种轨迹推断方法在模拟数据（a）和Dynverse真实数据（b）上的基准测试结果。指标包括HIM分数、分支内细胞定位相关性、分支点F1、分支F1和准确率。PHLOWER在大多数指标上排名第一。c和d分别展示了胰腺祖细胞和神经发生数据上PAGA、Monocle3和PHLOWER推断的分化树，PHLOWER恢复了主要分支且假阳性较少。

亮点 2｜肾脏类器官多组学轨迹推断

对iPS细胞来源的肾脏类器官进行多组学（RNA+ATAC）测序，获得13,751个细胞。PHLOWER推断出9个分支的分化树，与分化时间（day 7-25）和伪时间高度吻合。分支包括上皮细胞（足细胞和肾小管细胞）、基质细胞以及肌肉/神经元细胞（脱靶细胞）。通过结合TF活性评分和差异表达分析，PHLOWER识别出足细胞调控因子WT1和MAFB、肾小管调控因子HNF1B和GRHL2，以及神经元分支的PAX3、RFX4和ZIC2。这些结果验证了PHLOWER在多模态数据上推断复杂轨迹和识别关键调控因子的能力。

图 3　Fig. 3。图3展示了肾脏类器官多组学数据的PHLOWER分析结果。a为推断的9分支分化树；b和c显示细胞按分化时间和伪时间有序排列；d为各分支标记基因的小提琴图；e为分支特异性TF及其活性评分，包括足细胞（WT1、MAFB）、肾小管（HNF1B、GRHL2）和神经元（PAX3、RFX4、ZIC2）等。

亮点 3｜空间转录组验证与扰动实验

利用Xenium空间成像技术对day 19和day 25的肾脏类器官进行亚细胞分辨率分析，共检测105,092个细胞。PHLOWER在空间数据上重建了分化树，并确认了与多组学分析一致的细胞类型和TF表达模式。对比day 19和day 25，发现day 25的肾小管细胞和足细胞比例显著增加，表明类器官成熟度提高。通过siRNA敲低PAX3、RFX4和ZIC2，观察到肾小管细胞和足细胞祖细胞比例显著增加，而肌肉、基质和神经元细胞减少。免疫荧光证实vimentin阳性基质细胞减少，nephrin和E-cadherin表达增加，表明敲低脱靶神经元调控因子可改善肾脏类器官的分化。

图 4　Fig. 4。图4展示了肾脏类器官的Xenium空间分析。a为day 19和day 25的空间细胞类型分布；b为PHLOWER在空间数据上推断的分化树（105,092细胞）；c为单细胞置换检验显示day 25与day 19相比，肾小管和足细胞比例增加，中胚层细胞减少；d为空间数据中TF表达模式与多组学预测一致。

补充图

图 5　Fig. 5。图5展示了siRNA敲低PAX3、RFX4和ZIC2后的空间分析结果。a为scrambled和siRNA条件下day 25类器官的空间细胞类型分布；b为置换检验显示siRNA组肾小管细胞和足细胞祖细胞比例显著增加，肌肉、基质和神经元细胞减少；c-f为免疫荧光图像和定量，显示vimentin减少，nephrin和E-cadherin增加。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 单纯复形、霍奇拉普拉斯分解、调和特征向量、轨迹嵌入、多模态整合、空间转录组
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞轨迹推断、多组学整合、类器官分化或发育生物学研究的生物信息学家和实验生物学家。

带走一句

PHLOWER利用单纯复形上的调和分量，为多模态单细胞数据提供了可扩展的复杂分化树推断框架，并能识别分支特异性调控因子，为类器官优化和疾病研究提供了新工具。