IF46.9｜AZD7648增强HDR却引发大规模基因组重排

用AZD7648提高HDR效率，可能换来染色体臂丢失和易位。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）能够精确引入外源序列，但效率通常较低。为提高HDR效率，研究者尝试抑制NHEJ通路，其中DNA-PKcs抑制剂AZD7648因能显著提高HDR效率而备受关注。然而，此前对AZD7648在基因组编辑中的潜在副作用缺乏系统评估。短读长测序是评估编辑结果的常用方法，但可能遗漏大片段缺失、染色体臂丢失和易位等大规模基因组改变。

科学问题

卡在哪里： AZD7648在提高HDR效率的同时，是否会导致靶位点附近的大规模基因组重排尚不清楚。短读长测序无法检测到这些大片段改变，因此需要长读长测序、ddPCR、scRNA-seq和CAST-seq等方法进行系统评估。

本文要回答： 揭示AZD7648在基因组编辑中引起的靶位点大规模基因组改变，并评估其潜在风险。

技术路线

作者主要用了：长读长测序、ddPCR、scRNA-seq、CAST-seq、流式细胞术。

作者首先用短读长测序确认AZD7648提高HDR效率，但发现与流式细胞术结果不一致，提示存在短读长测序无法检测的等位基因丢失。随后，他们用长读长测序检测到AZD7648诱导的千碱基级缺失，并通过ddPCR和eGFP报告系统发现兆碱基级缺失和染色体臂丢失。进一步用scRNA-seq在原代细胞中验证了染色体臂丢失，并用CAST-seq检测到易位增加。最后，他们测试了Polθ抑制剂PolQi2能否减轻这些大规模改变。

图 1　Fig. 1。图1展示了AZD7648在多个细胞类型和基因座中增加短读长测序检测到的HDR频率，但长读长测序揭示其同时诱导千碱基级缺失。在RPE-1 p53-/-和HSPC中，AZD7648显著增加大于1 kb的缺失频率，最高达43.3%。

核心亮点

亮点 1｜AZD7648诱导千碱基级缺失

在多个细胞类型和基因座中，AZD7648处理使千碱基级缺失频率增加2.0至35.7倍，在GAPDH位点达到43.3%的reads。长读长测序显示，这些缺失在短读长测序中因等位基因丢失而被低估。在p53功能正常的细胞中，缺失频率较低但仍超过20%。在原代CD34+ HSPC中，AZD7648也增加了大缺失频率。

图 2　Fig. 2。图2通过eGFP报告系统、ddPCR、scRNA-seq和CAST-seq证明AZD7648导致染色体臂丢失和易位。编辑位点位于eGFP着丝粒侧时，eGFP丢失更显著；scRNA-seq显示上气道类器官和HSPC中染色体臂丢失；CAST-seq检测到易位增加。

亮点 2｜AZD7648导致染色体臂丢失

利用K-562 eGFP报告细胞系，作者发现AZD7648处理导致eGFP阴性细胞比例增加，ddPCR证实eGFP拷贝数丢失。编辑位点位于eGFP着丝粒侧时，eGFP丢失更显著，提示染色体臂丢失。进一步ddPCR显示，距离编辑位点52 Mb的KMT2C拷贝数也丢失，表明缺失可延伸至整个染色体臂。

亮点 3｜scRNA-seq揭示原代细胞染色体臂丢失

对编辑后的上气道类器官和CD34+ HSPC进行scRNA-seq，发现AZD7648处理导致6.5 Mb端粒侧基因表达丢失，模式与染色体臂丢失一致。在上气道类器官中，高达47.8%的细胞表现出这种丢失；在HSPC中为22.5%。

亮点 4｜AZD7648增加易位频率

CAST-seq分析显示，AZD7648处理显著增加了CD34+ HSPC中的易位位点数量和频率。在RPE-1细胞中，AZD7648也增加了易位，尤其在p53缺失细胞中更为明显。

亮点 5｜PolQi2部分缓解大规模缺失

联合使用Polθ抑制剂PolQi2可减少AZD7648诱导的千碱基级缺失，同时保持HDR效率。然而，PolQi2未能减轻兆碱基级缺失和染色体臂丢失。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 长读长测序、ddPCR、scRNA-seq、CAST-seq、流式细胞术
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事基因编辑、HDR优化或基因治疗研究的科研人员。

带走一句

评估基因编辑结果时，短读长测序会漏掉大片段缺失和重排，必须结合长读长测序、ddPCR或scRNA-seq。