IF50.5｜利用蛋白-代谢物共变发现LRRC58调控半胱氨酸分解

LRRC58作为E3泛素连接酶底物适配器，响应半胱氨酸水平降解CDO1，控制肝脏胆固醇。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

代谢过程由蛋白质和代谢物共同执行，但两者之间的调控关系往往不依赖于直接物理结合，且亲和力低，难以研究。传统方法受限于重组蛋白和纯化代谢物的可用性，且多在非天然条件下进行，无法捕捉体内途径水平的调控。此前，作者团队已开发出基于遗传多样性远交小鼠（DO小鼠）的蛋白质共变分析方法，用于鉴定活体组织中的蛋白质功能合作关系。DO小鼠具有接近人类的遗传和表型异质性，为研究生物分子间的功能关联提供了理想模型。在此基础上，本文将蛋白质组与代谢组数据结合，旨在系统揭示活体组织中代谢物与蛋白质之间的功能关系，并进一步探索疾病相关代谢过程的调控机制。

科学问题

卡在哪里： 现有方法无法在活体组织中原位、大规模地鉴定代谢物与蛋白质之间的功能关系，尤其是那些不依赖于直接物理相互作用的调控模式。此外，半胱氨酸分解代谢的关键酶CDO1的翻译后调控机制尚不清楚，其蛋白稳定性如何被调节以响应细胞半胱氨酸水平仍是未解之谜。

本文要回答： 开发一种基于质谱的共变分析方法，系统注释代谢物与蛋白质之间的功能关系，并利用该方法揭示半胱氨酸分解代谢的调控机制，特别是CDO1蛋白稳定性的控制因素。

技术路线

作者主要用了：蛋白质组、代谢组、LASSO回归、共变分析、AP-MS、TR-FRET、AlphaFold2。

作者利用163只基因型明确的雌性DO小鼠，对肝脏和棕色脂肪组织进行深度蛋白质组和代谢组分析，共定量11,868种蛋白质和285种代谢物。通过计算蛋白质与代谢物丰度之间的相关性，构建代谢物-蛋白质共变架构（MPCA）。随后，采用LASSO回归模型从共变数据中筛选出预测代谢物丰度的关键蛋白质，并优先选择具有高验证评分的代谢物进行功能验证。以半胱氨酸分解代谢途径中的hypotaurine为切入点，LASSO分析发现LRRC58是其最强的负向预测因子，进而通过一系列细胞和生化实验验证LRRC58对CDO1的调控作用。

图 1　Fig. 1。图1展示了DO小鼠的遗传多样性和组织选择。a图显示DO小鼠的育种方案和遗传多样性；b图比较了本研究与既往研究在蛋白质和代谢物覆盖度上的差异，显示本研究在低丰度蛋白质检测上具有优势；c图示意了蛋白质与代谢物丰度相关性的过滤流程。整体上，该图说明了MPCA构建的样本基础和数据规模。

核心亮点

亮点 1｜MPCA系统注释代谢物-蛋白质功能关系

作者在163只DO小鼠的肝脏和棕色脂肪组织中定量了11,868种蛋白质和285种代谢物，构建了代谢物-蛋白质共变架构（MPCA）。共鉴定出482,043对显著相关的蛋白质-代谢物对（FDR<0.05），其中134,740对为协同关系，359,062对为拮抗关系。MPCA成功重现了27%的Rhea数据库中已知的酶-底物/产物关系（n=1,373），以及26%的TCDB数据库中已知的转运体-底物关系（n=46），表明共变分析能够捕捉直接物理相互作用和局部代谢途径调控。此外，代谢物的蛋白质相关物数量与其参与的生化反应数量正相关，提示MPCA可反映代谢物在生物网络中的功能广度。

图 2　Fig. 2。图2展示了LASSO回归识别hypotaurine调控蛋白的过程。a图为LASSO回归原理示意图；b图显示在棕色脂肪组织中，CDO1正向预测hypotaurine，而LRRC58负向预测；c图显示LRRC58与hypotaurine在肝脏和棕色脂肪组织中均呈负相关；d图显示敲低LRRC58增加原代肝细胞中hypotaurine和taurine水平；e图显示过表达LRRC58降低Hep G2细胞中hypotaurine和taurine；f和g图显示敲低LRRC58增加半胱氨酸向hypotaurine和taurine的转化通量。

亮点 2｜LASSO回归发现LRRC58调控hypotaurine

利用LASSO回归模型，作者从MPCA数据中筛选出3,542个此前未知的蛋白质-代谢物预测关系。在棕色脂肪组织中，81种蛋白质共同预测hypotaurine丰度，其中CDO1是最强的正向预测因子，而LRRC58是最强的负向预测因子。在肝脏中也观察到类似趋势。LRRC58是一种功能未知的蛋白质，这一发现提示其可能参与半胱氨酸分解代谢的调控。后续实验证实，敲低LRRC58导致原代棕色脂肪细胞和肝细胞中hypotaurine和taurine水平显著升高，而过表达LRRC58则降低这些代谢物，表明LRRC58负向调控半胱氨酸向taurine的转化。

图 3　Fig. 3。图3揭示了LRRC58通过CRL5 E3连接酶降解CDO1的机制。a和b图显示敲低LRRC58导致CDO1蛋白丰度显著增加；c和d图显示在原代肝细胞中也有类似现象；e和f图显示过表达LRRC58降低CDO1蛋白水平；g图显示LRRC58与CDO1、CUL5、ELOB和ELOC存在相互作用；h图显示体外重组CRL5-LRRC58与CDO1形成复合物；i图显示TR-FRET测定LRRC58与CDO1的结合亲和力；j和k图显示AlphaFold2预测的复合物结构；l和m图显示体外泛素化实验证实LRRC58依赖的CDO1泛素化。

亮点 3｜LRRC58作为CRL5 E3连接酶底物适配器降解CDO1

蛋白质组学分析显示，敲低LRRC58导致CDO1蛋白丰度增加高达8倍，而过表达LRRC58则降低CDO1蛋白水平。免疫共沉淀和AP-MS实验证实LRRC58与CDO1、CUL5、ELOB和ELOC形成复合物。体外重组实验表明，CRL5-LRRC58复合物直接结合CDO1，并介导其泛素化降解。TR-FRET测定LRRC58与CDO1的解离常数Kd为4.67 μM。AlphaFold2多聚体模型预测了LRRC58与CDO1的结合界面，并指出CDO1的His147残基是LRRC58介导降解的关键位点。这些结果表明LRRC58是CRL5 E3泛素连接酶的底物适配器，靶向CDO1进行蛋白酶体降解。

图 4　Fig. 4。图4展示了半胱氨酸对LRRC58介导的CDO1降解的调控。a图显示半胱氨酸耗竭降低CDO1翻译后稳定性；b图显示半胱氨酸浓度梯度对CDO1稳定性的影响，且L-半胱氨酸特异性起作用；c图显示半胱氨酸补充稳定CDO1；d图显示半胱氨酸效应依赖于LRRC58；e图显示CDO1与LRRC58结合界面的关键残基；f图显示His147Ala突变使CDO1对LRRC58敲低不敏感；g图显示His147Ala突变使CDO1对半胱氨酸耗竭不敏感。

亮点 4｜半胱氨酸水平调控LRRC58介导的CDO1降解

利用CDO1翻译后稳定性荧光报告系统，作者发现半胱氨酸浓度变化可调节CDO1蛋白稳定性：半胱氨酸耗竭加速CDO1降解，而半胱氨酸补充则稳定CDO1。这种调节依赖于LRRC58，且对L-半胱氨酸具有立体特异性。CDO1的His147Ala突变使其对LRRC58介导的降解和半胱氨酸耗竭均不敏感，表明His147是响应半胱氨酸信号的关键残基。这些结果揭示了一个反馈回路：当半胱氨酸充足时，LRRC58介导的CDO1降解被抑制，促进半胱氨酸向taurine转化；当半胱氨酸缺乏时，CDO1被降解以保留半胱氨酸用于谷胱甘肽合成等必需功能。

图 5　Fig. 5。图5展示了肝脏LRRC58敲低对胆固醇代谢的影响。a-c图显示AAV介导的LRRC58敲低导致肝脏CDO1蛋白水平显著升高；d图显示肝脏总胆固醇降低；e图显示肝脏半胱氨酸水平降低；f图显示体内半胱氨酸向taurine的转化通量增加；g图显示肝脏胆汁酸总量减少；h图显示胆囊游离胆固醇含量增加；i和j图显示肝脏甘油三酯和脂肪酸中间体水平降低；k图显示DO小鼠中LRRC58蛋白丰度与肝脏胆固醇水平的相关性。

亮点 5｜肝脏LRRC58敲低降低胆固醇并促进胆汁酸排泄

在C57BL/6J小鼠中通过AAV介导的shRNA敲低肝脏LRRC58，导致CDO1蛋白水平增加18倍，肝脏总胆固醇降低24.7%，半胱氨酸水平降低35.6%。体内示踪实验显示，LRRC58敲低增加了半胱氨酸向taurine的转化通量。肝脏胆汁酸总量减少25.5%，而胆囊游离胆固醇含量增加19.5%，表明胆汁酸排泄增强。此外，LRRC58敲低还降低了肝脏甘油三酯、脂肪酰基肉碱和脂肪酸中间体水平，提示肝脏脂肪酸代谢重塑。这些效应在同时敲低CDO1后被逆转，证实LRRC58通过CDO1调控肝脏胆固醇代谢。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 蛋白质组、代谢组、LASSO回归、共变分析、AP-MS、TR-FRET、AlphaFold2
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事代谢调控、蛋白质降解、多组学整合分析的科研人员。

带走一句

共变分析结合LASSO回归可系统发现代谢调控新机制，为功能未知蛋白的注释提供高效路径。