IF50.5｜空间同时测DNA甲基化和转录组的新技术

同一张组织切片上，同时拿到全基因组甲基化和转录组空间图谱，分辨率接近单细胞。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

DNA甲基化是调控基因表达和细胞命运的关键表观遗传标记，在不同细胞类型、发育阶段和疾病状态下动态变化。单细胞甲基化测序已经揭示了细胞异质性，但组织解离丢失了空间位置信息。近年来空间转录组和空间表观组学技术（如空间ATAC-seq、空间CUT&Tag）快速发展，但空间DNA甲基化分析一直缺失。DNA甲基化在发育和疾病中的空间分布规律，以及它与基因表达的空间耦合关系，是理解组织生物学的重要问题。

科学问题

卡在哪里： 现有空间多组学技术只能测转录组、染色质可及性或组蛋白修饰，无法直接检测DNA甲基化。单细胞甲基化测序虽然能获得全基因组甲基化谱，但组织解离破坏了空间背景，无法回答“甲基化差异发生在组织的哪个位置”以及“甲基化与基因表达在空间上如何协同变化”的问题。

本文要回答： 开发一种能在同一组织切片上同时进行全基因组DNA甲基化和转录组空间分析的方法，并用它解析小鼠胚胎发育和出生后大脑中的表观遗传调控机制。

技术路线

作者主要用了：空间多组学、DNA甲基化测序、转录组测序、微流控条形码、EM-seq。

作者设计了一种名为spatial-DMT的方法。首先对组织切片进行固定、透化和盐酸处理以暴露DNA，然后用Tn5转座酶进行两轮片段化，同时用带生物素的引物捕获mRNA进行逆转录。接着通过微流控芯片依次加上两组空间条形码（A和B），形成二维网格，每个像素点有唯一的条形码组合。之后用链霉亲和素磁珠分离cDNA和基因组DNA：cDNA用于构建转录组文库，基因组DNA经过EM-seq酶法转化（将未甲基化胞嘧啶变为尿嘧啶）后构建甲基化文库。最后对两个文库分别测序，得到同一组织切片的DNA甲基化和基因表达空间图谱。

图 1　Fig. 1。图1展示了spatial-DMT的实验流程：组织切片经固定、透化、盐酸处理、Tn5转座和逆转录后，通过微流控芯片依次加上两组空间条形码，然后分离cDNA和gDNA分别建库测序。右侧展示了E11胚胎的DNA甲基化、RNA和WNN整合聚类结果的空间分布，以及不同分辨率下的数据质量指标。

核心亮点

亮点 1｜胚胎空间图谱揭示甲基化与表达的双向调控

对E11小鼠胚胎进行spatial-DMT分析，DNA甲基化和RNA表达分别聚类后，通过WNN整合得到更精细的空间细胞类型图谱。在脑、脊髓、颅面和心脏等区域，许多标志基因（如Runx2、Mapt、Trim55）的表达与邻近VMR的低甲基化相关，符合经典负调控模式。但同时也发现Ank3、Atp11c等基因表达与甲基化正相关，提示甲基化调控的复杂性。此外，motif富集分析显示，组织特异性转录因子（如心脏的Hand2、Tbx20）的结合位点在其表达区域呈现低甲基化，说明甲基化可能通过影响转录因子结合来调控基因表达。

图 2　Fig. 2。图2展示了E11胚胎脑和脊髓区域（W2）差异甲基化位点的热图及邻近基因表达热图，以及Runx2、Mapt、Trim55等标志基因的空间表达和甲基化模式。还展示了Ank3等基因表达与甲基化正相关的例子，以及组织特异性转录因子motif富集结果。

亮点 2｜10μm分辨率解析神经发育精细结构

使用10μm像素的微流控芯片对E11胚胎颅面和前脑区域进行高分辨率分析，成功区分出端脑祖细胞（W11）和GABA能皮质中间神经元（W7）等精细细胞类型。通过与scRNA-seq参考数据整合和细胞类型反卷积，证实W11定位于脑室区的增殖性神经祖细胞，W7定位于套层的迁移神经元。GO富集分析进一步支持了这些区域的功能特征。此外，还解析了嗅觉感觉神经元（W5）的空间分布，与发育中嗅觉系统与前脑的连接轨迹一致。

图 3　Fig. 3。图3展示了少突胶质细胞分化轨迹的空间拟时序分析，以及伴随的VMR去甲基化和基因表达变化热图。还展示了E11和E13胚胎整合后的空间图谱、差异基因和差异甲基化区域，以及DNA甲基化相关酶的表达变化。

亮点 3｜跨发育阶段整合揭示甲基化动态与基因激活

整合E11和E13小鼠胚胎的空间数据，发现从E11到E13，许多基因上调表达并伴随邻近VMR的去甲基化。例如，神经元发育相关基因Usp9x、Ank3、Shank2在脑区表达升高且甲基化降低；心脏发育基因Ctnna1、Pecam1、Lamb1也呈现类似模式。GO分析显示这些基因富集于突触组织、神经元投射等过程。同时，DNA甲基化相关酶（Dnmt1、Dnmt3a、Mecp2、Tet1）在E13表达升高，提示甲基化动态的生化基础。此外，对少突胶质细胞分化轨迹的拟时序分析显示，甲基化丢失既可伴随基因激活（Nrg3）也可伴随基因沉默（Pdgfra），进一步证明甲基化调控的多样性。

图 4　Fig. 4。图4展示了P21小鼠大脑切片的明场图像和不同聚类（DNA甲基化、RNA、WNN）的空间分布。散点图显示了DG、CA1/2和CA3区域标志基因的mCG/mCA甲基化变化与基因表达变化的关系，以及Prox1、Ntrk3、Cux1等基因的空间表达和甲基化模式。

亮点 4｜P21大脑中mCG与mCA对基因表达的不同调控

对P21小鼠大脑皮层和海马区域进行spatial-DMT分析，发现mCA（非CpG甲基化）在神经元中富集，且在不同脑区存在差异。通过比较mCG和mCA与基因表达的相关性，发现Prox1和Bcl11b的表达同时受mCG和mCA调控，而Ntrk3和Satb1主要受mCG调控，Cux1在CA3区受mCG和mCA共同抑制，但在CA1/2区仅与mCA负相关。这些结果表明mCG和mCA以基因特异性和区域特异性的方式调控转录，共同定义细胞身份。

图 5　Fig. 5。图5展示了相邻WNN聚类间差异甲基化区域的染色质特征富集分析，以及同一WNN聚类内不同空间位置的差异甲基化区域和转录因子motif富集。还展示了E11、E13和P21大脑中PMD甲基化的空间分布，以及同一RNA聚类内不同DNA甲基化亚群的motif富集和基因表达差异。

亮点 5｜空间甲基化揭示有丝分裂历史和表观遗传启动

利用部分甲基化结构域（PMD）作为有丝分裂历史的指标，发现E11和E13胚胎中不同区域的PMD甲基化水平存在空间梯度：心脏从中心到外周逐渐升高，前脑和脊髓从套层到脑室区逐渐降低，反映了祖细胞增殖和分化的空间组织。在P21大脑中，皮层PMD甲基化较高（分化神经元），而齿状回较低（存在神经干细胞）。此外，同一RNA聚类内的细胞可根据DNA甲基化分为不同亚群，这些亚群在motif富集上显示不同的发育调控特征，但基因表达差异有限，提示表观遗传启动状态。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 空间多组学、DNA甲基化测序、转录组测序、微流控条形码、EM-seq
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 做空间多组学、表观遗传学、发育神经生物学的研究者，以及关注新技术方法开发的生信人员。

带走一句

空间多组学分析不能只看转录组，DNA甲基化能提供独立且互补的细胞状态信息，整合两者可以揭示被单模态分析掩盖的细胞异质性和调控机制。