IF50.5｜CRISPR 筛选发现 RHOG 敲除增强 CAR T 细胞疗效

CELLFIE 平台系统筛选出 RHOG 与 FAS 双敲除，显著提升 CAR T 细胞抗肿瘤能力。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

CAR T 细胞疗法在血液肿瘤中取得显著成功，但 CAR T 细胞功能障碍是治疗失败的常见原因。临床前和临床研究已发现多种限制疗效的细胞内在障碍，包括 T 细胞适应性和增殖能力有限、慢性 CAR 刺激导致的耗竭、免疫抑制和营养贫乏的肿瘤微环境，以及 CAR T 细胞通过胞啃作用获得靶细胞抗原后引发的自相残杀。已有研究表明，通过基因编辑敲除免疫检查点（如 PD-1、CTLA4）、表观遗传调控因子（如 PRDM1）或信号蛋白（如 RASA2）等可以增强 CAR T 细胞功能。然而，这些发现多为零散研究，缺乏系统性筛选策略来全面发现能够提升 CAR T 细胞疗效的基因靶点。

科学问题

卡在哪里： 此前研究多聚焦于单个基因的验证，缺乏在人类原代 CAR T 细胞中进行全基因组 CRISPR 筛选的系统性方法，且体外筛选结果难以直接转化为体内疗效。此外，体内混合筛选面临 CAR T 细胞在器官中频率低、gRNA 扩增效率差以及细胞群体瓶颈和随机漂移等技术障碍，限制了大规模体内验证的开展。

本文要回答： 开发一个整合体外全基因组筛选、体内混合验证和组合筛选的 CELLFIE 平台，系统发现能够增强 CAR T 细胞疗效的基因敲除，并验证其在多种模型中的抗肿瘤效果。

技术路线

作者主要用了：CRISPR 全基因组筛选、流式分选、体内 CROP-seq、组合筛选、碱基编辑筛选。

作者首先构建 CROP-seq-CAR 载体，实现 CAR 和 gRNA 文库的共递送，并通过 mRNA 电穿孔递送 CRISPR 编辑器，建立 CELLFIE 平台。在体外，利用增殖筛选和四种 FACS 筛选（CD19 胞啃、CD69 激活、FAS 凋亡、PD-1/LAG3/TIM3 耗竭）进行全基因组 CRISPR 敲除筛选。随后，开发基于 CROP-seq 的体内混合筛选方法，在白血病异种移植模型中验证候选基因。对筛选出的 RHOG 和 FAS 进行单敲除和双敲除的体内功能验证，并通过组合筛选和碱基编辑筛选进一步探索协同基因对和 RHOG 的功能位点。

图 1　Fig. 1。图1展示CELLFIE平台的整体流程：原代T细胞经激活、慢病毒转导（携带CAR和gRNA文库）和mRNA电穿孔（递送CRISPR编辑器）后，进行体外和体内功能筛选。b部分显示全基因组适应度筛选的时间线，包括T细胞分离、激活、转导、电穿孔和抗生素选择等步骤。

核心亮点

亮点 1｜CELLFIE 平台实现高效 CAR T 细胞筛选

作者开发了 CELLFIE 平台，通过 CROP-seq-CAR 载体共递送 CAR 和 gRNA 文库，并利用 mRNA 电穿孔递送 CRISPR 编辑器，实现高效基因编辑（>80% 敲除效率）。该平台支持多种 CRISPR 模式（敲除、碱基编辑、激活），并优化了培养、转导、电穿孔和筛选流程。利用该平台，作者进行了 58 个全基因组筛选，覆盖增殖、靶细胞识别、激活、凋亡和耗竭等多个生物学过程，数据质量优于先前的人类原代 T 细胞筛选。

图 2　Fig. 2。图2展示FACS筛选的四种读out：CD19胞啃（靶细胞识别）、CD69激活、FAS凋亡和PD-1/LAG3/TIM3耗竭。b部分验证了FACS标记基因敲除在标记阴性细胞中的强富集，c部分展示四个筛选方向（CD19高、CD69高、FAS极低、三阴性耗竭标志物）的筛选结果。

亮点 2｜体内 CROP-seq 筛选发现 RHOG 等增强基因

作者开发了基于 CROP-seq 的体内混合筛选方法，通过 mRNA 读取 gRNA 并引入 UMI 进行克隆追踪，解决了 CAR T 细胞在器官中频率低和群体瓶颈问题。在白血病异种移植模型中，从 39 个候选基因中筛选出 FAS、PRDM1 和 RHOG 三个基因敲除能显著增强 CAR T 细胞在脾脏和骨髓中的富集（log2[FC] > 1.5, FDR < 0.01），其中 RHOG 是意外发现，因其缺失在人类中导致单基因免疫缺陷。

图 3　Fig. 3。图3展示体内混合筛选的实验设计：NSG小鼠注射NALM6细胞诱导白血病，然后回输非治愈剂量的CAR T细胞（含体外筛选命中的敲除）。b部分展示体内CROP-seq载体设计，gRNA位于3' LTR并带有UMI。c部分比较了传统DNA扩增与mRNA扩增的gRNA比对率，d部分显示UMI内部重复分析显著提高了筛选灵敏度，识别出FAS、PRDM1和RHOG等基因。

亮点 3｜RHOG 与 FAS 双敲除协同增强抗肿瘤疗效

在白血病异种移植模型中，RHOG 敲除 CAR T 细胞实现显著的白血病细胞清除和生存延长，效果与 FAS 敲除相当或更优。RHOG 和 FAS 双敲除进一步大幅延长生存期，并在部分小鼠中实现治愈。该效果在多种 CAR 设计（19-BBz、19-28z、GD2-BBz）、不同供体和患者来源细胞中均得到验证，且在实体瘤模型中也观察到肿瘤清除增强。

图 4　Fig. 4。图4展示RHOG和FAS敲除的体内验证：a部分为实验时间线，b-d部分显示RHOG敲除、FAS敲除和双敲除CAR T细胞在白血病模型中的肿瘤负荷和生存曲线，双敲除显著延长生存。e部分汇总了多个验证实验的生存数据。f-h部分展示RHOG敲除对CAR T细胞表型的影响，包括中央记忆比例增加、体内扩增增强和耗竭标志物降低。

亮点 4｜RHOG 敲除促进增殖并减少耗竭

机制研究表明，RHOG 敲除 CAR T 细胞在慢性抗原刺激下表现出更高的增殖能力，RNA-seq 显示 DNA 复制、细胞周期和核糖体代谢相关基因上调。流式分析发现 RHOG 敲除增加中央记忆表型（CD62L+CD45RO+）比例，并在体内降低耗竭标志物 LAG3、TIM3 和 TIGIT 的表达。这些变化与 FAS 敲除的抗凋亡作用互补，解释了双敲除的协同效应。

图 5　Fig. 5。图5展示组合筛选和碱基编辑筛选：a部分为组合筛选时间线，使用CROP-seq-CAR-multi载体在三种CAR中筛选238个基因对组合。b部分展示双gRNA载体设计。c部分显示RHOG和FAS双敲除在三种CAR中均表现最强富集。d-g部分展示RHOG的饱和碱基编辑筛选，识别出GTP结合口袋中的关键氨基酸。

亮点 5｜组合筛选与碱基编辑筛选拓展发现

作者将组合筛选整合进 CELLFIE 平台，利用 CROP-seq-CAR-multi 载体同时递送两个 gRNA，筛选了 238 个基因对组合，验证了 RHOG 和 FAS 双敲除的协同作用，并发现其他潜在协同基因对。此外，通过饱和碱基编辑筛选，对 RHOG 进行高分辨率功能定位，发现 GTP 结合口袋中的关键氨基酸（如 Lys16、Cys18）对其抑制 CAR T 细胞功能至关重要，为临床转化提供了无 DNA 双链断裂的碱基编辑策略。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CRISPR 全基因组筛选、流式分选、体内 CROP-seq、组合筛选、碱基编辑筛选
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事 CAR T 细胞工程、CRISPR 筛选或肿瘤免疫治疗研究的科研人员。

带走一句

系统性 CRISPR 筛选结合体内混合验证，能够高效发现增强 CAR T 细胞疗效的基因靶点，为细胞治疗优化提供了可扩展的蓝图。