IF46.9｜Droplet Hi-C实现异质组织单细胞染色质构象高通量解析

微流控液滴法让单细胞Hi-C通量提升一个数量级，并能在单细胞水平区分ecDNA与HSR。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

染色质三维构象在发育和疾病中调控基因表达，异常构象与癌症等疾病密切相关。单细胞Hi-C技术近年发展迅速，但现有方法主要分为低通量微孔板法和高通量组合索引法。微孔板法如Dip-C、sn-m3C-seq等通量有限、操作繁琐、成本高；组合索引法如sci-Hi-C、GAGE-seq虽通量较高，但流程冗长且依赖手工操作，难以普及。此外，癌症中常见的染色体结构变异（SV）和染色体外DNA（ecDNA）在肿瘤异质性和治疗耐药中起关键作用，但bulk Hi-C难以解析肿瘤内异质性，且无法区分ecDNA与均质染色区（HSR）。因此，亟需一种高通量、易操作、能解析复杂组织异质性的单细胞染色质构象技术。

科学问题

卡在哪里： 现有单细胞Hi-C方法要么通量低、成本高，要么操作复杂难以推广；同时，缺乏能在单细胞水平可靠区分ecDNA与HSR的工具，限制了肿瘤异质性和耐药机制的研究。

本文要回答： 开发一种基于商用微流控液滴平台的高通量单细胞Hi-C方法（Droplet Hi-C），并验证其在复杂组织细胞类型解析、癌症染色体异常检测及ecDNA动态监测中的能力。

技术路线

作者主要用了：Droplet Hi-C、Paired Hi-C、scHiCluster、Higashi、EagleC、NeoLoopFinder、深度学习ecDNA识别。

作者将原位Hi-C与10x Genomics单细胞ATAC微流控平台结合，在液滴中完成单细胞染色质片段化与条形码标记，实现高通量建库。首先用细胞系混合物验证方法分辨率和准确性，然后应用于小鼠皮层组织，通过GAD评分与scRNA-seq共嵌入注释细胞类型，分析区室、TAD边界、染色质环及多向互作。在癌症研究中，利用Droplet Hi-C推断CNV、SV，并开发基于卷积神经网络的ecDNA识别模型，区分ecDNA与HSR。进一步在GBM细胞系和临床样本中追踪ecDNA动态及细胞状态异质性。最后改良为Paired Hi-C，同时捕获转录组和染色质构象，用于联合分析。

图 1　Fig. 1。图1展示Droplet Hi-C工作流程：原位Hi-C后利用10x ATAC微流控平台进行单细胞条形码标记。与其他单细胞Hi-C方法相比，通量提高一个数量级，实验时间和成本显著降低。小鼠皮层数据UMAP显示20种细胞类型清晰分离，包括神经元、胶质细胞等。

核心亮点

亮点 1｜小鼠皮层20种细胞类型染色质构象解析

Droplet Hi-C对成年小鼠皮层产生6,235个高质量单细胞图谱，中位unique read pairs达175,021。通过GAD评分与snRNA-seq共嵌入，成功注释出20种细胞类型（5种非神经元、9种谷氨酸能、6种GABA能）。细胞类型特异性的染色质区室、TAD边界和染色质环清晰可见，例如Satb2基因在ITL6GL和PTGL神经元中显示特异性长程互作并伴随H3K27ac激活标记。系统分析发现895个差异区室与组蛋白修饰相关，Pdgfra基因座存在OPC特异性TAD边界，且表达变异大的基因更易与可变TAD边界关联。多向染色质互作分析鉴定出约5%的基因组bin为细胞类型特异性hub，富集于超级增强子和标记基因，揭示了复杂组织中细胞类型特异的基因调控景观。

图 2　Fig. 2。图2展示小鼠皮层细胞类型间染色质构象差异。a显示差异区室的热图，b显示区室评分与H3K27ac/H3K27me3信号的相关性分布。c中Pdgfra基因座在OPC中显示特异性TAD边界。d-e显示边界概率与附近基因表达变异相关。f显示H3K27ac在loop锚点富集，g显示细胞类型特异loop锚点的GO富集。h-j展示多向互作hub的鉴定及与超级增强子和标记基因的关联。

亮点 2｜单细胞Hi-C区分ecDNA与HSR

在COLO320DM（MYC位于ecDNA）和COLO320HSR（MYC位于HSR）细胞系中，bulk Hi-C的adjnTIF指标无法区分两者。作者开发了基于hub index（Gini系数）、拷贝数和trans/cis比值的逻辑回归模型，以及基于卷积神经网络的深度学习模型。深度学习模型对MYC ecDNA预测达到0.80敏感性、0.99特异性、0.93准确性，在COLO320DM中96%细胞检出ecMYC，而COLO320HSR中99.54%细胞为HSR。该模型还能在全基因组范围内扫描ecDNA，为后续肿瘤样本分析提供了可靠工具。

图 3　Fig. 3。图3展示COLO320DM和COLO320HSR细胞系的CNV和SV分析。a显示伪bulk和单细胞CNV，ecMYC区域在COLO320DM中高扩增。b显示chr6上的SV。c显示两种细胞系MYC位点的全基因组互作图谱和adjnTIF相似。d显示ecDNA与HSR的trans互作模式差异。e显示hub index在ecDNA中更低。f-g显示MYC拷贝数和trans/cis比值差异。h-i展示深度学习模型架构及在COLO320DM中96%细胞检出ecMYC。

亮点 3｜GBM39耐药过程中ecDNA动态演化

对GBM39细胞及厄洛替尼耐药株GBM39-ER进行Droplet Hi-C分析，共9,204个细胞分为5个亚群。耐药后C2亚群几乎消失，C0扩增，并出现C1、C3、C4新亚群。ecEGFR在耐药后几乎消失，而ecMDM2新出现并富集于C3亚群；ecMYC在C0和C3中频率升高，且其边界和内部结构在耐药细胞中呈现高度异质性，DNA FISH验证了5' MYC单独扩增的细胞。单细胞拷贝数推断显示ecMYC边界在GBM39中一致，但在GBM39-ER中变异巨大，提示厄洛替尼诱导了新的ecMYC结构形成，而非选择预先存在的亚克隆。

图 4　Fig. 4。图4展示GBM39细胞厄洛替尼处理前后ecDNA动态。a为处理流程。b-d显示UMAP聚类及亚群比例变化，C2消失，C0扩增，新亚群出现。e显示各亚群中ecEGFR、ecMYC、ecMDM2的阳性率和接触图，ecEGFR消失，ecMDM2出现，ecMYC结构改变。f显示ecMYC和ecEGFR共存的细胞及FISH验证。g显示ecMYC边界在GBM39-ER中高度变异。h显示DNA FISH验证5' MYC单独扩增。

亮点 4｜原发GBM样本中恶性细胞染色质异常与细胞状态

对一例IDH野生型GBM肿瘤样本进行Droplet Hi-C，聚类区分恶性与非恶性细胞。恶性细胞显示chr7扩增、chr10缺失，EGFR位点被识别为ecDNA样扩增，DNA FISH证实EGFR扩增子分散分布。ecDNA caller确认恶性细胞富集ecEGFR。还发现恶性细胞特异的SV，包括IKZF1与ecEGFR的易位导致IKZF1转录下调。通过共嵌入将恶性细胞分为NPC-like、OPC-like、AC-like和MES-like四种状态，发现状态特异基因表达与区室变化一致，如CSMD1在OPC/NPC-like中位于A区室，在MES/AC-like中位于B区室。ecEGFR拷贝数在AC-like和MES-like细胞中更高，且ecDNA上基因表达与状态相关，不完全由拷贝数解释。

图 5　Fig. 5。图5展示原发GBM样本分析。a为细胞状态分析流程。b显示UMAP分离恶性与非恶性细胞。c-d显示恶性细胞chr7扩增、chr10缺失及EGFR位点ecDNA样特征。e显示恶性与非恶性细胞拷贝数中位谱。f显示ecEGFR在恶性细胞中富集及DNA FISH验证。g显示恶性细胞特异SV，包括IKZF1与ecEGFR易位。h-i显示恶性细胞分为四种状态。j-k显示ecEGFR阳性率和拷贝数在AC/MES-like中更高。l-m显示EGFR表达和染色质可及性。n-o显示ecDNA上基因表达与状态的相关性。

亮点 5｜Paired Hi-C联合染色质构象与转录组

改良Droplet Hi-C为Paired Hi-C，使用10x Multiome试剂盒同时捕获Hi-C和RNA。小鼠皮层获得12,361个联合单细胞图谱，Hi-C中位42,210 read pairs，RNA中位3,914 UMI和1,746基因。RNA数据成功注释20种细胞类型，与参考数据集一致。区室评分与Droplet Hi-C和sn-m3C-seq高度相关，并发现Erbb4等基因的区室状态与表达一致。在GBM39耐药模型中，Paired Hi-C显示ecMYC拷贝数与基因表达总体相关，但边界可变区基因如CCDC26表达与拷贝数解偶联。还发现ecMYC的trans互作模式与基因表达响应相关，提示ecDNA可能通过染色质互作调控全局转录。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： Droplet Hi-C、Paired Hi-C、scHiCluster、Higashi、EagleC、NeoLoopFinder、深度学习ecDNA识别
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞多组学、三维基因组、肿瘤基因组学和ecDNA研究的科研人员。

带走一句

Droplet Hi-C把单细胞Hi-C从手工微孔板或组合索引带入商用微流控时代，通量和可及性大幅提升；其ecDNA识别模型为肿瘤异质性和耐药研究提供了新工具。