IF36.1｜单细胞DNA-RNA联合测序直接关联基因变异与表达

SDR-seq在数千单细胞中同时捕获gDNA和RNA，将基因型与表达表型直接挂钩。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

基因组变异（编码区和非编码区）驱动人类群体差异和疾病，但超过90%的GWAS变异位于非编码区，其基因调控影响难以评估。现有遗传筛选（如CRISPRi/激活）忽视精确变异，而精准编辑工具效率低且结果多变，难以在混合筛选中用gRNA作为变异扰动代理。基于液滴或分裂池的单细胞方法虽能高通量，但gDNA和RNA联合读取灵敏度低、等位基因脱扣率高（>96%），无法在单细胞水平正确判定变异合子性。外源报告系统（如MPRA）缺乏内源基因组位置和序列背景。因此，需要一种能在同一细胞内直接、高灵敏度地同时读取gDNA和RNA的技术，以系统研究内源遗传变异对基因表达的影响。

科学问题

卡在哪里： 现有单细胞多组学技术无法同时实现高通量和高灵敏度的gDNA与RNA联合检测，导致变异合子性判定困难，且非编码变异的功能评估缺乏内源背景。

本文要回答： 开发一种可扩展、高灵敏度的单细胞DNA-RNA联合测序方法，以直接关联内源编码和非编码变异与基因表达变化。

技术路线

作者主要用了：SDR-seq、靶向多重PCR、液滴微流控、原位逆转录、CRISPRi、碱基编辑、单细胞分析。

作者开发了SDR-seq，结合固定细胞原位逆转录和基于Tapestri的液滴多重PCR，在同一细胞内扩增gDNA和RNA靶标。通过反向引物上不同的overhang（R2N和R2）分别构建gDNA和RNA测序文库，实现高覆盖度检测。首先在iPS细胞中验证了方法的灵敏度和特异性，然后测试了不同panel大小（120/240/480靶标）的可扩展性，并评估了染色质状态和表达水平对检测的影响。接着利用CRISPRi、prime editing和base editing系统验证SDR-seq检测基因表达变化的能力，最后应用于原发性B细胞淋巴瘤样本，关联体细胞变异与肿瘤基因表达和成熟状态。

图 1　Fig. 1。图1展示了SDR-seq工作流程和概念验证结果。a部分显示反向引物上的R2N/R2 overhang分别用于gDNA和RNA文库构建。b部分概述POP实验设计，比较PFA和glyoxal固定。c-d显示约9000个细胞通过质控，两种固定条件细胞数均衡。e-f显示>95%的reads映射到正确样本BC。g-i显示23/28个gDNA靶标在大多数细胞中高覆盖检测，且PFA和glyoxal间差异小。j-l显示RNA靶标表达水平各异，glyoxal条件下检测和UMI覆盖更高。m-o显示SDR-seq与bulk RNA-seq高度相关，且比10x和ParseBio数据方差更低。

核心亮点

亮点 1｜SDR-seq实现高灵敏度单细胞多组学

在概念验证实验中，SDR-seq从单次运行获得约9000个细胞，gDNA靶标检测率达82%，且覆盖均匀；RNA靶标检测随表达水平变化，与bulk RNA-seq高度相关（r>0.9）。物种混合实验显示gDNA交叉污染<0.16%，RNA交叉污染0.8-1.6%，且可通过样本条形码去除。与10x和ParseBio数据相比，SDR-seq基因表达方差更低，测量稳定性更高。该方法在数千细胞中同时检测gDNA和RNA，为后续应用奠定基础。

图 2　Fig. 2。图2评估了SDR-seq的可扩展性和稳健性。a部分显示panel大小测试设计，共享靶标用于跨panel比较。b-e显示共享gDNA和RNA靶标的检测和覆盖在各panel间高度相关（Pearson r>0.9），表明panel大小影响小。f-g显示不同染色质状态（H3K4me3、H3K27ac、DNase敏感）和基因重叠与否对gDNA检测无系统影响。h-j显示高、中表达基因在几乎所有细胞中检测到，低表达基因检测率降低，但共享基因表达水平在各panel间高度一致。

亮点 2｜可扩展至480个靶标且检测稳定

在120、240和480靶标panel测试中，80%的gDNA靶标在>80%的细胞中被高置信检测，共享靶标的检测和覆盖在各panel间高度相关（Pearson r>0.9），表明panel大小对检测影响小。RNA靶标检测也类似，低表达基因检测率略降。等位基因脱扣率在检测率>80%的扩增子中为6-13%，变异噪声<0.15%。染色质状态（H3K4me3、H3K27ac、DNase敏感）和基因重叠与否对gDNA检测无系统影响，证明SDR-seq可广泛应用于不同基因组区域。

图 3　Fig. 3。图3展示了SDR-seq检测基因表达变化的能力。a-b显示CRISPRi实验设计及火山图，95%的TSS靶向gRNA显著降低靶基因表达，而24%的eQTL gRNA和60%的STOP对照gRNA也显著降低表达。c-e显示prime editing实验设计及结果，仅STOP对照导致显著表达变化，其中ATF4和MYH10的STOP引入导致表达降低，而SOX11无变化。f-g显示碱基编辑实验设计及火山图，多个eQTL变异对靶基因表达产生显著影响。h显示POU5F1 3'UTR变异组合与表达水平显著相关。

亮点 3｜敏感检测CRISPRi和碱基编辑效应

CRISPRi实验中，95%的TSS靶向gRNA显著降低靶基因表达，而24%的eQTL靶向gRNA和60%的STOP对照gRNA也显著降低表达，且显著eQTL gRNA均位于TSS 2kb内。碱基编辑实验中，多个eQTL变异对靶基因表达产生显著影响，且发现POU5F1 3'UTR区域的体细胞变异组合与表达水平显著相关。这些结果表明SDR-seq能检测强和微妙的基因表达变化，并揭示直接评估内源变异的重要性。

图 4　Fig. 4。图4展示了SDR-seq在原发性B细胞淋巴瘤中的应用。a部分显示样本信息和靶标panel。b-c显示UMAP聚类，RNA和变异数据均能区分B细胞和非B细胞，并映射成熟状态。d显示变异在恶性B细胞和非B细胞中的分布，部分变异仅存在于恶性B细胞。e显示基于变异的克隆结构，克隆间DZ/LZ比例不同。f显示BCL2变异在LZ中富集。g-h显示LZ中BCR信号和肿瘤基因表达上调。i显示高突变负荷细胞具有更高的BCR信号评分。

亮点 4｜淋巴瘤中变异负荷与肿瘤信号关联

在3例原发性B细胞淋巴瘤样本中，SDR-seq同时分析3600-8400个细胞，区分恶性B细胞和非B细胞，并基于变异信息鉴定克隆结构。BCL2变异在LZ中富集，且高突变负荷细胞表现出升高的B细胞受体信号和肿瘤基因表达。差异表达分析显示LZ中参与BCR信号和肿瘤发生的基因上调。这些发现表明高突变负荷细胞可能通过增强BCR信号逃避凋亡，促进肿瘤进展。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： SDR-seq、靶向多重PCR、液滴微流控、原位逆转录、CRISPRi、碱基编辑、单细胞分析
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞多组学、癌症基因组学或非编码变异功能研究的科研人员。

带走一句

SDR-seq为单细胞水平直接关联基因型与表达表型提供了高通量、高灵敏度的解决方案，尤其适用于非编码变异的功能解析。