IF50.5｜工程酵母为蜜蜂提供必需花粉甾醇

改造解脂耶氏酵母生产蜜蜂必需甾醇，实现无花粉育子。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

蜜蜂是重要传粉昆虫，但农业集约化和气候变化导致花粉短缺，威胁蜂群健康。花粉为蜜蜂提供蛋白质、脂质和微量营养素，其中甾醇是必需成分，参与膜结构、激素合成等关键生理过程。蜜蜂自身不能合成甾醇，需从花粉中获取。商业花粉替代品缺乏必需甾醇，无法维持蜂群育子。此前研究已鉴定出蜜蜂幼虫发育所需的几种关键甾醇，但尚未实现大规模生产。

科学问题

卡在哪里： 花粉中的必需甾醇在商业规模上难以获取，且酵母工程改造生产非天然甾醇存在产量低、立体选择性差等问题，尤其是解脂耶氏酵母缺乏甾醇摄取转运体，内源麦角固醇合成必需，难以直接敲除后期途径基因。

本文要回答： 构建能生产蜜蜂所需甾醇混合物的解脂耶氏酵母菌株，并验证其作为花粉替代品支持蜂群育子的可行性。

技术路线

作者主要用了：CRISPR基因编辑、代谢工程、发酵工程、GC-MS、半田间喂养试验。

作者首先分析蜜蜂蛹中甾醇组成，确定六种关键甾醇。然后以解脂耶氏酵母为底盘，利用CRISPR技术敲除内源麦角固醇合成基因ERG4和ERG5，引入异源Δ7-甾醇还原酶等基因，重塑甾醇合成途径，构建生产24-亚甲基胆固醇及混合甾醇的菌株。通过小规模筛选和生物反应器发酵优化产量，最后将酵母生物质掺入人工饲料，进行蜂群喂养试验，评估对育子的影响。

图 1　Fig. 1。图1展示了蜜蜂从花粉获取甾醇并传递给幼虫的流程，以及不同蛹型中六种甾醇的相对丰度和总浓度。24-MC在三种蛹型中均占主导，但雄蜂蛹中24-MC比例更高，工蜂蛹中链甾醇比例更高。总甾醇浓度雄蜂蛹最高，工蜂蛹最低。花粉中甾醇组成变异大，β-谷甾醇中位丰度最高，24-MC仅5.84%。

核心亮点

亮点 1｜蜜蜂蛹中六种甾醇组成

对工蜂、雄蜂和蜂王蛹的甾醇分析显示，24-亚甲基胆固醇（24-MC）占60-70%，其余五种为β-谷甾醇、链甾醇、异岩藻甾醇、菜油甾醇和胆固醇。不同蛹型间相对丰度存在显著差异（sterol × pupal type, χ²₁₀=47.0, P<0.0001），雄蜂蛹中24-MC比工蜂蛹高11.8%，异岩藻甾醇比蜂王蛹高2.24倍。总甾醇浓度在130-260 μg/g鲜重之间，雄蜂蛹最高，工蜂蛹最低。这些甾醇与花粉中常见甾醇一致，为后续工程酵母设计提供了靶标。

图 2　Fig. 2。图2为酵母和植物甾醇合成途径示意图，标注了关键酶及其催化的反应。从甲羟戊酸到麦角固醇的途径中，ERG3、ERG5、ERG4等酶负责后期修饰。通过敲除ERG4和ERG5，引入异源DWF5/DHCR7、SSR1、SMT、SSR2等酶，可将途径导向24-MC及其他目标甾醇。图中用叉号表示敲除，箭头表示异源酶引入。

亮点 2｜酵母工程生产24-MC

以解脂耶氏酵母平台菌株（过表达甲羟戊酸途径基因）为底盘，引入四膜虫鲨烯-四膜虫醇环化酶（STC1）作为甾醇替代物，敲除ERG4和ERG5，筛选异源Δ7-甾醇还原酶。来自Tetraselmis sp.的DWF5变体效果最佳，小规模培养24-MC产量达42.1 mg/g DCW，远高于其他变体，且中间产物积累少。该产量是植物油或花粉中甾醇含量的8倍，证明了平台菌株的潜力。

图 3　Fig. 3。图3a比较了不同来源DWF5/DHCR7变体在解脂耶氏酵母中生产24-MC的能力，Tetraselmis sp.的DWF5产量最高（42.1 mg/g DCW）。图3b显示逐步工程化菌株的甾醇谱，从24-MC菌株到混合甾醇菌株，逐步添加CAMP、ISOFUC、SITO、CHOL和DESMO。图3c-d为5L生物反应器发酵结果，混合甾醇菌株生物量达48-50 g/L，甾醇含量8.46-9.76 mg/g DCW，24-MC占65%。

亮点 3｜混合甾醇菌株构建

在24-MC菌株基础上，逐步引入马铃薯Δ24(28)-甾醇还原酶（SSR1）产生菜油甾醇，藜麦C-28甾醇甲基转移酶（SMT）产生异岩藻甾醇和β-谷甾醇，番茄Δ24(25)-甾醇还原酶（SSR2）产生胆固醇和链甾醇。最终混合甾醇菌株在小规模培养中产生24-MC（24.6 mg/g DCW）、菜油甾醇、异岩藻甾醇、胆固醇、链甾醇和痕量β-谷甾醇，总甾醇含量28.0 mg/g DCW。5L生物反应器发酵后，24-MC占总甾醇约65%，其余五种甾醇占15%，四膜虫醇占20%。

图 4　Fig. 4。图4展示不同饲料组蜂群在试验最后两个月的卵、幼虫和封盖蛹数量。卵数随时间下降但不受饲料影响；幼虫数在第75天MxSt组显著高于Tet组；封盖蛹数在第75天和第91天MxSt组均显著高于所有对照组。箱线图显示MxSt组在试验末期仍维持一定数量的蛹，而对照组几乎为零。

亮点 4｜混合甾醇饲料支持育子

将混合甾醇酵母生物质以20%掺入人工饲料，进行3个月蜂群喂养试验。从第45天起，混合甾醇饲料组（MxSt）的幼虫数在第75天显著高于四膜虫醇对照组（P=0.0109），蛹数在第75天和第91天均显著高于所有对照组（P<0.05）。第91天时，MxSt组仍有10-40个封盖蛹房，而对照组几乎为零。结果表明，工程酵母提供的甾醇混合物能有效支持蜂群在无花粉条件下育子。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CRISPR基因编辑、代谢工程、发酵工程、GC-MS、半田间喂养试验
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事代谢工程、合成生物学、昆虫营养或农业生物技术的研究人员。

带走一句

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