IF50.5｜FCoV-23刺突丢失D0增强融合与入胞动力学

猫冠状病毒FCoV-23在体内高频丢失刺突D0，该缺失显著提升膜融合和入胞速度。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

冠状病毒跨种传播威胁人类和动物健康。FCoV-23是2023年在塞浦路斯猫群中暴发的高致病性重组猫冠状病毒，引起猫传染性腹膜炎（FIP）。基因组测序显示其刺突（S）基因与犬冠状病毒CB/05样病毒重组，且在超过90%的临床样本中检测到S蛋白N端D0结构域的框内缺失，提示存在宿主内进化。D0是α冠状病毒特有的糖结合结构域，可能介导与细胞表面唾液酸的附着，但其在FCoV-23感染中的具体作用尚不清楚。

科学问题

卡在哪里： 此前对FCoV-23 S蛋白的结构、受体使用及D0缺失的功能后果缺乏了解。D0缺失在临床样本中高频出现，但其是否影响病毒进入、融合及致病性尚无实验证据。

本文要回答： 解析FCoV-23 S蛋白结构，鉴定其受体，并阐明D0缺失对膜融合和入胞动力学的影响。

技术路线

作者主要用了：冷冻电镜、BLI、假病毒入胞、细胞-细胞融合、蛋白酶切割、血凝试验。

作者首先解析了FCoV-23 S-long（含D0）和S-short（缺失D0）的冷冻电镜结构，发现D0缺失不引起整体构象变化。随后通过BLI和假病毒实验鉴定APN为受体，并解析了RBD与猫APN的复合物结构。接着利用细胞-细胞融合实验和假病毒入胞动力学实验比较S-long与S-short的功能差异，发现D0缺失显著增强融合和入胞速度。最后通过抗原性分析评估交叉中和潜力。

图 1　Fig. 1。图1展示FCoV-23 S-long的两种冷冻电镜结构：D0“外摆”构象（a）和混合构象（b），以及S-short结构（未显示）。与CCoV-HuPn-2018 S1和S2亚基叠加的r.m.s.d.分别为0.89 Å和1.3 Å，表明结构高度相似。结构引导的系统发育分析将FCoV-23 RBD与CCoV-HuPn-2018、TGEV、PRCV等聚类，而FCoV-1 RBD则相距较远。

核心亮点

亮点 1｜D0缺失增强膜融合

在BHK-21细胞与多种表达猫APN的靶细胞（Fcwf-CU、CRFK）的融合实验中，FCoV-23 S-short介导的GFP阳性面积显著大于S-long，且差异在多个时间点均存在。外源胰蛋白酶处理可部分增强S-long的融合，但仍低于S-short。类似现象在CCoV-HuPn-2018 S中同样观察到，表明D0对融合的抑制作用在α冠状病毒中可能具有保守性。

图 2　Fig. 2。图2显示BLI结合分析：FCoV-23 RBD与FcAPN和CfAPN结合，但不与人APN或鸡APN结合。假病毒入胞实验表明FcAPN、CfAPN和SsAPN能介导FCoV-23 S入胞，人APN不能，但人APN N739糖基化敲入突变可恢复入胞。RBD与FcAPN复合物的冷冻电镜结构揭示了关键相互作用残基，包括Y549、Q551和W592。

亮点 2｜D0缺失加速入胞动力学

VSV假病毒入胞实验显示，在感染后3-8小时，S-short假病毒在Fcwf-CU和CRFK细胞中的入胞效率分别是S-long的1.35-3.9倍。MLV假病毒在8小时时间点也显示S-short入胞效率更高（Fcwf-CU 4.1倍，A-72 41倍）。这些差异在24小时后减小，提示D0缺失主要影响早期入胞速度，而非最终入胞总量。

图 3　Fig. 3。图3显示1AF10 Fab对FCoV-23 S-short和S-long假病毒的中和曲线，IC50与CCoV-HuPn-2018相当。HCoV-229E S疫苗诱导的小鼠血清对FCoV-23 S-short和CCoV-HuPn-2018 S的中和活性微弱，而对HCoV-229E S完全中和，表明抗原距离较远。

亮点 3｜APN为FCoV-23受体

BLI实验显示FCoV-23 RBD与猫APN（FcAPN）和犬APN（CfAPN）高亲和力结合（Kd,app分别为11 nM和1.3 nM），但不结合人APN。假病毒实验证实FcAPN、CfAPN和猪APN均能介导FCoV-23 S入胞，而人APN不能。人APN N739位点糖基化敲入突变（R741T）可恢复入胞，猫APN糖基化敲除（T742R）则显著降低入胞，表明该糖基化是物种嗜性的关键决定因素。

图 4　Fig. 4。图4显示细胞-细胞融合动力学：FCoV-23 S-short在BHK-21与FcAPN表达细胞、Fcwf-CU和CRFK细胞中的融合面积均显著大于S-long。CCoV-HuPn-2018 S-short也表现出增强的融合。VSV假病毒入胞动力学显示S-short在早期时间点入胞效率更高。蛋白酶抑制剂实验表明FCoV-23主要通过内体途径入胞。

亮点 4｜交叉中和抗体1AF10抑制FCoV-23

靶向PRCV和TGEV RBD的单克隆抗体1AF10的Fab片段可剂量依赖性中和FCoV-23 S-short和S-long假病毒，效力与对CCoV-HuPn-2018相当。而HCoV-229E S疫苗诱导的小鼠血清对FCoV-23仅有微弱或无中和活性，提示FCoV-23与HCoV-229E抗原距离较远，但与CCoV-HuPn-2018、PRCV、TGEV等关系密切。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 冷冻电镜、BLI、假病毒入胞、细胞-细胞融合、蛋白酶切割、血凝试验
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 研究冠状病毒入侵、跨种传播和疫苗设计的科研人员，以及关注病毒演化与致病机制的生信学者。

带走一句

D0缺失是FCoV-23在体内高频出现的适应性变化，通过增强融合和入胞速度可能促进病毒扩散和致病。分析病毒演化时，结构域丢失的功能后果值得关注。