IF50.5｜小鼠肝脏类组装体模拟汇管区结构及胆管纤维化

利用肝细胞、胆管细胞和间充质细胞构建的类组装体，成功模拟了汇管区结构和胆管纤维化进程。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

肝脏由六边形的肝小叶组成，每个角落有汇管区，中央有中央静脉。肝细胞是高度极化的细胞，形成胆小管网络，将胆汁排入胆管。胆小管与胆管连接失调会导致胆汁淤积性肝病，进而发展为纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。在胆汁淤积性疾病中，汇管区间充质细胞（尤其是门静脉成纤维细胞）和胆管细胞被激活并扩增。空间转录组分析揭示了健康及胆汁淤积肝脏汇管区中参与细胞间通讯的许多分子，但这些分子如何影响稳态、再生或纤维化仍不清楚。现有体外系统（如类器官）仅由上皮细胞组成，无法重现汇管区的复杂细胞组成和结构。

科学问题

卡在哪里： 此前开发的体外肝脏模型（包括肝细胞类器官、胆管细胞类器官及多能干细胞来源的类器官）均无法同时重现肝细胞极性、功能性胆小管三维网络以及汇管区上皮-间充质细胞相互作用。二维培养虽能形成胆小管，但缺乏三维网络结构；胆管细胞-间充质共培养缺少肝细胞成分。因此，缺乏一个能够模拟汇管区细胞组成、结构及功能的体外系统。

本文要回答： 构建包含肝细胞、胆管细胞和门静脉间充质细胞的类组装体，重现汇管区结构和功能，并利用该系统模拟胆汁淤积性损伤和胆管纤维化。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、RNA-seq、免疫荧光、活细胞成像、拓扑数据分析、细胞通讯分析。

作者首先优化肝细胞类器官（HepOrgs）培养条件，通过添加Wnt信号通路激活剂获得具有功能性胆小管网络的类器官。随后将HepOrgs与胆管细胞和门静脉间充质细胞按生理比例混合，在旋转平台或AggreWell中形成类组装体。通过改变间充质细胞比例诱导纤维化样状态，并利用scRNA-seq、RNA-seq、免疫荧光和活细胞成像等手段分析类组装体的细胞组成、基因表达、细胞间相互作用及功能。最后，通过基因敲低和嵌合类组装体实验验证该系统用于研究基因功能和细胞自主机制的可行性。

图 1　Fig. 1。图1展示了肝汇管区的结构示意图和免疫荧光图像，显示CD34+门静脉成纤维细胞、OPN+胆管细胞和肝细胞的定位。优化后的HepOrgs在HM-Wnt或HM-WntS培养基中生长良好，形成葡萄状结构，具有更长的胆小管网络和更多分支，接近体内组织。

核心亮点

亮点 1｜优化HepOrgs形成功能性胆小管网络

作者在原有肝细胞类器官培养基中添加Wnt3a或Wnt替代物，显著提高了类器官形成效率和尺寸。通过拓扑数据分析区分出球形和葡萄状两种形态，其中葡萄状结构具有更长、更分支且相互连接的胆小管网络，并能分泌胆汁酸类似物CLF和代谢5-CFDA，表明其胆小管功能正常。在MM培养基中培养的HepOrgs胆小管直径分布更接近体内生理范围（1.5-2.5 μm），且网络连通性更好。免疫荧光显示ZO-1和CD13定位于顶端膜，E-cadherin定位于基底侧，证实了肝细胞极性的正确建立。

图 2　Fig. 2。图2显示HepOrgs在MM培养基中表现出部分肝小叶分区特征：外周细胞高表达谷氨酰胺合成酶（GS）等中央静脉周围标志物，而内部细胞表达门静脉周围标志物。胆小管直径分布分析显示MM培养的HepOrgs胆小管直径集中在1.5-2.5 μm，与体内一致，而HM-Wnt培养的HepOrgs胆小管直径分布更宽。

亮点 2｜类组装体重现汇管区细胞组成与结构

将HepOrgs、胆管细胞和门静脉间充质细胞按生理比例混合，在旋转平台上形成类组装体，效率约70%，预适应后可提高至90%。类组装体中三种细胞保持各自谱系标志物表达，且细胞比例与体内组织相似。免疫荧光显示胆管细胞形成具有开放管腔的胆管结构，周围被间充质细胞包裹，嵌入肝细胞实质中，重现了汇管区的空间组织。scRNA-seq分析表明类组装体细胞与体内对应细胞类型高度相似，间充质细胞富集基底膜和ECM相关基因，胆管细胞富集细胞连接基因，肝细胞富集代谢相关基因。

图 3　Fig. 3。图3展示了类组装体的构建流程和结果。通过旋转平台或AggreWell将HepOrgs、胆管细胞和间充质细胞混合，形成具有胆管结构（KRT19+）和间充质包裹的类组装体。scRNA-seq UMAP显示三种细胞类型分离良好，且与体内对应细胞聚类重叠。免疫荧光显示胆小管与胆管直接相连，CLF转运实验证实连接具有功能性。

亮点 3｜胆小管与胆管形成功能性连接

免疫荧光和三维重建显示，类组装体中胆小管网络与胆管管腔直接相连，连接方式与体内Hering管相似。在含有胆管细胞的类组装体中，100%观察到胆小管-胆管连接。活细胞成像显示CLF从肝细胞胆小管网络转运至胆管管腔，证实连接具有功能性。此外，该连接促进了细胞分化：肝细胞上调胆汁酸转运蛋白基因（Abcb4、Abcc2、Abcc3），胆管细胞表达Ezr和Ano1等顶端极性和转运蛋白标志物。

图 4　Fig. 4。图4展示了纤维化样类组装体的特征。与稳态类组装体相比，间充质细胞过量导致肝细胞凋亡、胆管细胞扩增和胶原沉积增加。scRNA-seq整合分析显示纤维化样类组装体的细胞与体内纤维化模型细胞聚类相近。细胞通讯分析揭示间充质-间充质和肝细胞-间充质间存在与纤维化相关的配体-受体对。

亮点 4｜间充质细胞过量诱导纤维化样表型

在保持肝细胞和胆管细胞数量不变的情况下，将间充质细胞数量增加10倍，类组装体出现纤维化样改变：肝细胞数量减少、形态异常、凋亡增加（cleaved caspase-3阳性），胆管细胞数量增加，纤维状胶原沉积增多（SHG信号增强）。RNA-seq显示纤维化样类组装体中胆管细胞标志物（Krt7、Sox9、Krt19）和多种胶原基因（Col1a2、Col3a1）表达上调。scRNA-seq整合分析显示纤维化样类组装体的细胞与体内胆管结扎和CCl4模型中的对应细胞聚类相近，且细胞间通讯分析发现与纤维化相关的配体-受体对（如Col1a1-Ddr2、Gas6-Axl、Timp2-Itgb1等）显著富集。

图 5　Fig. 5。图5展示了利用类组装体研究纤维化机制的实验。siRNA敲低Cdh11或Itgb1可阻止纤维化样形态变化和胶原沉积。Mdr2−/−肝细胞类器官表现出胆小管扩张、顶端隔膜等胆汁淤积特征，与体内Mdr2−/−小鼠肝脏相似。嵌合类组装体实验显示Mdr2−/−肝细胞足以诱导胆管细胞扩增。

亮点 5｜CDH11和ITGβ1在纤维化中起关键作用

通过siRNA敲低间充质细胞中的Cdh11或Itgb1，显著抑制了纤维化样类组装体的形态变化（DETECT指标显示形状保持稳定），并减少了胶原沉积。这表明间充质细胞间的粘附（CDH11）和间充质-ECM相互作用（ITGβ1）在纤维化进程中发挥重要作用。此外，利用Mdr2−/−小鼠来源的肝细胞类器官构建嵌合类组装体，发现Mdr2−/−肝细胞足以诱导胆管细胞扩增，提示肝细胞功能障碍可自主驱动胆管反应。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、RNA-seq、免疫荧光、活细胞成像、拓扑数据分析、细胞通讯分析
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事肝脏疾病研究、类器官构建、细胞间通讯分析及纤维化机制研究的科研人员。

带走一句

该研究提供了一种模块化的体外肝脏类组装体系统，可用于研究汇管区细胞间相互作用及胆汁淤积性纤维化的细胞自主和非自主机制，为疾病建模和药物筛选提供了新平台。