IF50.5｜病理导向多重成像实现疾病整合图谱

PathoPlex框架以亚细胞分辨率同时解析上百种蛋白，将空间蛋白组学推向疾病机制发现。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

空间生物学技术通过保留组织学背景提供分子表达的空间信息，多重成像将抗体标记扩展到传统3-4种以上。现有商业系统如IMC和CODEX分别提供约40和56个标记，但分辨率多在250-1000 nm/像素，且主要依赖单细胞分割分析。这限制了从同一组织同时获取细胞结构、亚细胞定位和信号通路活性等多层次信息的能力。肾脏等高细胞密度器官的研究通常只报告细胞身份和状态，缺乏跨生物层次的整合数据。

科学问题

卡在哪里： 现有方法在抗体面板大小和图像分辨率之间存在权衡，平均仅37个标记、267 nm/像素，难以实现亚细胞结构解析和多层次整合分析。此外，缺乏针对FFPE临床样本的可扩展、质量控制严格且计算可解释的框架，限制了从组织病理档案中挖掘疾病相关特征的能力。

本文要回答： 开发一个可扩展、质量控制严格且可解释的框架，结合高分辨率多重成像和计算分析，从FFPE组织中提取跨生物层次的蛋白共表达模式，用于疾病机制解析和药物靶点发现。

技术路线

作者主要用了：高多重免疫荧光成像、像素级聚类、SOM、Leiden图聚类、GPU加速Python库spatiomic。

作者开发了PathoPlex框架，采用迭代间接免疫荧光成像（4i）原理，使用未修饰商业抗体在FFPE切片上进行循环染色、成像和抗体洗脱。通过优化玻片包被（APTES）和3D打印自动化液体处理，实现大规模样本并行处理。同时开发了spatiomic Python库，利用GPU加速进行图像配准、预处理、SOM降维和Leiden图聚类，从像素级识别蛋白共表达模式（clusters）。首先在三种器官中进行原理验证，然后以肾脏为模型，在三个数据集中验证：小鼠免疫性肾病模型（34标记，80 nm/像素）、人晚期糖尿病肾病（61标记，160 nm/像素）和青少年2型糖尿病早期肾活检（142标记，80 nm/像素）。

图 1　Fig. 1。图1展示PathoPlex框架总览：左侧为高多重成像流程（循环染色-成像-洗脱），右侧为spatiomic分析流程（从图像配准到聚类解释）。b部分说明聚类解释步骤：先分析标记贡献，再空间投影验证。c部分总结三个主要数据集：小鼠肾病模型（34标记）、人DKD（61标记）和人早期T2D（142标记），显示规模递增。

核心亮点

亮点 1｜PathoPlex实现>140抗体、80nm分辨率

PathoPlex在95个成像循环中检测了150个蛋白（142层用于分析），分辨率达80 nm/像素，生成超过6000亿像素。使用NHS-E作为泛蛋白标记进行图像配准和前景分割，比DAPI或DRAQ5更稳定且无需重复染色。通过APTES包被玻片，组织脱落率仅1%。3D打印的自动化液体处理系统节省约70%手动时间，可同时处理40个完整肾活检样本。

图 2　Fig. 2。图2展示小鼠免疫性肾病模型的概念验证实验。a为实验设计：NTS诱导急性损伤和CGN，40个ROI，34标记。b显示不同疾病阶段clusters的空间分布变化。c举例说明四个具有生物学意义的clusters（C28、C21、C4、C7）的组成和定位。d显示Cluster 21（pJUN）在疾病中显著增加。e显示Cluster 21在PECs和肾小管细胞中的分布动态。f-h为JUN活性验证实验：体外PEC迁移抑制、人类样本pJUN+CD44+ PECs检测、大鼠CC930治疗实验。i-k显示CC930降低蛋白尿、减轻肾小球损伤并调节CD44表达。

亮点 2｜小鼠模型揭示JUN活性为疾病开关

在免疫介导的肾病小鼠模型中，PathoPlex识别出33个clusters，其中27个具有生物学意义。Cluster 21以磷酸化JUN（pJUN）为主要贡献者，在急性损伤和CGN中均显著增加，且主要定位于壁层上皮细胞（PECs）和肾小管细胞。体外实验证实JNK抑制剂CC930可减弱PDGF诱导的PEC迁移。在人类CGN样本中，pJUN+CD44+ PECs仅出现在病变肾小球中。大鼠模型中，CC930预防性治疗显著降低蛋白尿，治疗性干预减轻肾小球损伤并调节CD44表达。

图 3　Fig. 3。图3展示人DKD整合图谱。a为实验设计：38例样本（18对照，20 DKD），422个ROI，61标记。b以Cluster 19为例展示从聚类识别到差异丰度分析的流程，并投影到PAS染色图像上验证。c显示单细胞分割后识别出疾病特异性metaclusters（如MC16在DKD中增加）。d显示Cluster 28（ECM重塑）与eGFR的相关性。e为UnPaSt双聚类结果，准确区分对照和DKD。f为药物重定位分析，显示SGLT2抑制剂等与扩展DKD签名蛋白的相互作用。g为公共snRNA-seq数据验证cGMP信号与TRPC6相关线粒体应激的关联。

亮点 3｜人DKD整合图谱发现TRPC6相关肾小管应激

对38例人肾样本（18对照，20 DKD）的422个ROI分析，使用61个标记，识别出18个差异丰度clusters。Cluster 19（AIFM1和TRPC6为主要贡献者）在DKD中增加，定位于近端小管。免疫金电镜和IMC验证了TRPC6在近端小管的表达。单细胞分割后，metacluster 16在DKD中增加，包含多个近端小管损伤相关过程。Cluster 28（ECM重塑）与肾功能（eGFR）显著相关。UnPaSt双聚类准确区分对照和DKD样本。

图 4　Fig. 4。图4展示早期T2D无组织学病变时的肾应激特征及SGLT2i影响。a为实验设计：18例样本（5健康，6 T2D未用SGLT2i，7 T2D用SGLT2i），284个ROI，142标记，140个clusters。b显示组间差异丰度clusters的火山图。c举例展示受调控的亚细胞clusters（如线粒体、管周毛细血管等）。d显示SGLT2i对T2D相关变化的逆转效果：部分恢复管周毛细血管和线粒体完整性，但未完全正常化。e为提出的DKD早期病理连续体模型，展示从早期肾小球和肾小管间质改变到DKD的进展。

亮点 4｜药物重定位分析提示PDE5抑制剂潜力

基于DKD差异clusters的贡献蛋白构建扩展DKD签名，并与CTD数据库交叉引用，发现SGLT2抑制剂等现有降糖药与签名蛋白存在相互作用。进一步分析公共scRNA-seq数据（GSE220939）证实签名在转录水平的改变，且SGLT2i部分逆转近端小管转录变化。通过药物-蛋白相互作用分析，提出磷酸二酯酶-5抑制剂可能调节TRPC6信号，为DKD治疗提供新思路。

亮点 5｜早期T2D无组织学病变时已现肾应激特征

对18例无组织学肾病的T2D患者（5健康，6未用SGLT2i，7用SGLT2i）的284个ROI，使用142个标记，生成140个clusters。24个clusters在组间显著差异，包括T2D中基质细胞丝状伪足、系膜基质和血管平滑肌细胞相关clusters增加，近端小管结构功能、线粒体完整性等clusters减少。SGLT2i部分逆转这些变化，如恢复管周毛细血管和线粒体完整性，但未完全恢复至健康状态。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 高多重免疫荧光成像、像素级聚类、SOM、Leiden图聚类、GPU加速Python库spatiomic
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事空间蛋白组学、肾脏病理学或药物重定位研究，希望利用FFPE样本进行高内涵分析的生信人员。

带走一句

PathoPlex证明，通过像素级蛋白共表达聚类而非仅单细胞分割，能从FFPE组织中提取跨层次疾病特征，且这些特征可关联药物反应和临床结局。