IF46.9｜人iPS细胞分化出可长期多系重建的造血干细胞

无需转基因，仅靠时序性生长因子调控即可从iPS细胞获得可移植的造血干细胞。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

人多能干细胞（PS细胞）定向分化为具有长期多系重建能力的造血干细胞（HSC）是再生医学的重要目标。胚胎发育中，HSC起源于主动脉-性腺-中肾（AGM）区的生血内皮，经历内皮-造血转化（EHT）产生。既往研究通过转录因子过表达或与基质细胞共培养等方法，虽能获得部分造血细胞，但长期多系重建能力有限，且机制不清。单细胞转录组分析揭示AGM区HSC具有独特的HOXA基因表达特征，为体外分化提供了分子标志。然而，如何在化学成分明确的培养体系中，通过时序性调控信号通路，重现胚胎HSC发育的微环境，仍是领域内亟待解决的难题。

科学问题

卡在哪里： 此前从iPS细胞分化获得的造血细胞大多缺乏长期多系重建能力，或依赖外源转录因子过表达，且分化体系常含血清等不确定成分，难以解析关键信号通路。

本文要回答： 建立一种化学成分明确、无需转基因的分化方案，从人iPS细胞高效产生具有长期多系重建能力的造血干细胞。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、流式细胞术、免疫缺陷小鼠移植模型、ACTINN机器学习分类。

作者采用旋转培养的拟胚体（EB）分化体系，通过分阶段添加小分子和生长因子模拟胚胎造血发育：先用CHIR99021和Activin A诱导中胚层，再用CHIR99021和SB431542促进HOXA基因表达，随后用BMP4、VEGF和视黄酸前体（RETA）诱导生血内皮，最后撤除VEGF促进内皮-造血转化。分化第14-16天收获悬浮的CD34+细胞，冻存后经尾静脉移植到NBSGW免疫缺陷小鼠，评估长期多系重建能力。同时利用scRNA-seq解析分化细胞与胚胎AGM区HSC的转录组相似性，并通过机器学习算法ACTINN进行细胞类型注释。

图 1　Fig. 1。图1展示旋转EB分化方案及第14天造血细胞表型。a为分化阶段示意图，从iPS细胞经中胚层、生血内皮到造血细胞。b显示第7天培养皿中大量旋转EB。c为明场与荧光叠加图像，显示EB表面突出的细胞簇（类似主动脉内造血簇）及脱落到培养基中的血细胞。d为第14天悬浮细胞流式图，显示CD34+CD90+CD44+Kit+细胞占多数。e为EB解离后细胞流式图，包含基质、内皮和未脱落的造血细胞，其中少量表达CXCR4或CD73，提示近期来自内皮。

核心亮点

亮点 1｜视黄酸时序调控决定iHSC产生

在筛选实验中，作者发现分化第3-5天添加视黄酸前体（ROL或RETA）是获得多系重建细胞的关键。在134只移植小鼠中，接受4μM CHIR99021诱导中胚层并联合视黄酸处理的细胞，有17.6%（9/51）出现多系重建，而未加视黄酸的组别无重建。scRNA-seq显示，视黄酸处理上调CYP26B1、DHRS3、CRABP2等视黄酸代谢基因及Wnt/FGF信号调节因子，且长时间处理（至第11天以上）才能充分激活这些基因。功能实验进一步表明，视黄酸处理至第13天时，多系重建率最高（36.8%），但处理至第15天反而下降，提示视黄酸信号需严格时序调控。

图 2　Fig. 2。图2展示筛选方案1及移植工作流程。a为分化条件矩阵，显示不同CHIR、BMP4、Activin A浓度及是否添加视黄酸。b为移植流程：从悬浮细胞和EB中分离CD34+细胞，冻存后尾静脉注射NBSGW小鼠。c-f为移植结果汇总，显示仅当使用4μM CHIR且添加视黄酸时出现多系重建，且重建水平与视黄酸处理相关。

亮点 2｜iHSC转录组与胚胎AGM区HSC高度相似

对分化第14天的细胞进行scRNA-seq，共获得252,607个细胞。聚类分析鉴定出HLF+SPINK2+的HSC样群体，其表达RUNX1、MECOM、MLLT3、HLF、HOXA9等HSC特征基因。与人类胚胎CS14-CS15期AGM区HSC比较，iPS细胞来源的HLF+SPINK2+细胞在9个基因集评分上高度一致。机器学习算法ACTINN将大部分iPS来源的HSC样细胞归类为CS14-CS15 AGM HSPC，且视黄酸处理时间越长，归类为AGM HSPC的比例越高。

图 3　Fig. 3。图3展示scRNA-seq实验设计及转录组分析。a为分化方案，两个iPS细胞系（RM TOM和PB1.1 BFP）在两种中胚层诱导条件下，接受不同时长的RETA处理。b-e为UMAP图，显示整合后的细胞聚类，鉴定出基质、内皮、生血内皮和造血细胞群。f为HSC特征基因在HLF+SPINK2+细胞中的表达。g为iPS来源HLF+SPINK2+细胞与胚胎CS14-CS15 AGM区HSC的基因表达比较。h为ACTINN分类结果，显示iPS来源HSC样细胞主要归类为CS14-CS15 AGM HSPC，且RETA处理时间越长，该比例越高。

亮点 3｜VEGF撤除增强内皮-造血转化和重建能力

作者发现，在分化第3-7天使用高浓度VEGF（150 ng/ml）可促进动脉内皮生成，但持续存在会抑制RUNX1表达和EHT。在第7天撤除VEGF后，CD34+CXCR4+动脉内皮细胞迅速失去CXCR4，同时RUNX1和HLF表达上调，表明EHT加速。将这一改良方案（protocol 3）用于移植实验，RM TOM细胞系的多系重建率从之前的24%提高到48.4%（30/62），且另外三个iPS细胞系（PB1.1 BFP、PB5.1、PB10.5）也获得26.7%-47.8%的多系重建率。

图 4　Fig. 4。图4展示筛选方案2及移植结果。a为分化方案，显示不同RETA处理时长（第3-5天、3-7天、3-9天、3-13天、3-15天）。b为散点图，显示骨髓中人源细胞比例与RETA处理时长的关系，第3-13天处理组多系重建率最高（36.8%）。c-g为多系重建小鼠的组织分析，包括骨髓中TOM+细胞共聚焦图像、骨髓和脾脏中红系、髓系、B细胞和T细胞的流式图，以及胸腺中T细胞发育阶段的流式图。

亮点 4｜iHSC移植后建立骨髓HSC龛并支持二次移植

在多系重建小鼠的骨髓中检测到CD45+CD34+CD38lo/-的HSC样细胞，表明iHSC能在体内建立干细胞龛。将原代移植小鼠的骨髓细胞二次移植到NBSGW小鼠，6/12只iHSC移植小鼠出现二次重建，但水平较低且多为髓系限制性；脐带血移植小鼠的二次重建率相似（2/5），提示iHSC与脐带血HSC在自我更新能力上相当，但可能弱于胚胎AGM来源的HSC。

图 5　Fig. 5。图5展示protocol 3分化方案及四个iPS细胞系的移植结果。a-d为四个细胞系（RM TOM、PB1.1 BFP、PB5.1、PB10.5）移植后骨髓和脾脏的重建水平及谱系分布。e-h为12周和16周时外周血中人源细胞比例的变化。i为骨髓中GYPA+红系和CD45+淋巴/髓系细胞的流式图。j为胸腺或纵隔淋巴结中T细胞和B细胞的流式图，显示CD4+CD8+双阳性细胞比例较低。

亮点 5｜iHSC重建水平与脐带血HSC相当

作者将iHSC与脐带血单个核细胞进行平行移植比较。脐带血中CD34+细胞频率为0.7-2.7%，当移植超过6,000个CD34+细胞时，14/15只小鼠出现多系重建。iHSC移植后，骨髓中人源细胞比例可达25-50%，部分小鼠超过70%，且在外周血中可持续增加至24周。极限稀释分析估计iHSC频率约为1/3×10^6 CD34+细胞，而脐带血HSC频率约为1/6.3×10^3 CD34+细胞，相差约20倍。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、流式细胞术、免疫缺陷小鼠移植模型、ACTINN机器学习分类
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事造血发育、干细胞分化或再生医学研究的科研人员，尤其是关注iPS细胞定向分化和移植模型的团队。

带走一句

时序性调控Wnt、视黄酸和VEGF信号，无需转基因即可从iPS细胞获得功能性HSC，为解析HSC发育机制和临床转化提供了可操作的平台。