IF31.7｜DNA测序高通量解析免疫肽组揭示癌症抗原呈递规律

ESCAPE-seq平台一次性评估7.5万个肽-HLA组合，发现跨人群共享的肿瘤新抗原。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

HLA-I类分子负责将细胞内蛋白片段呈递到细胞表面供CD8+ T细胞识别，是抗肿瘤和抗病毒免疫的核心。HLA基因是人类基因组中多态性最高的区域，不同HLA等位基因的肽结合偏好差异巨大。传统质谱（MS）方法虽然能直接鉴定免疫肽组，但受限于样本量、灵敏度低、难以区分多等位基因背景下的肽来源，且对低丰度但临床重要的突变肽或病原肽检出困难。计算预测工具如NetMHC虽然快速，但对训练数据不足的HLA等位基因（尤其是HLA-C）可靠性下降。现有免疫肽组数据高度偏向HLA-A2等少数常见等位基因，导致非欧洲裔人群的抗原呈递图谱严重缺失，限制了癌症免疫治疗的公平性和有效性。

科学问题

卡在哪里： 现有方法无法在人群规模上系统描绘HLA-I等位基因的肽呈递图谱。质谱方法通量低、成本高、对低丰度抗原不敏感；计算预测对HLA-C等训练数据少的等位基因准确率低；已有的高通量筛选方法如EpiScan不支持HLA-C，且不能同时评估多个HLA等位基因。因此，缺乏一个能够覆盖人群多样性、同时检测大量肽-HLA组合的实验平台。

本文要回答： 开发一种基于DNA测序的高通量平台，能够同时评估数万个肽-HLA组合，系统描绘跨人群的抗原呈递图谱，并鉴定癌症驱动突变和融合产生的新抗原。

技术路线

作者主要用了：单链三聚体（SCT）、慢病毒文库、流式分选、深度测序、组合条形码。

作者利用单链三聚体（SCT）设计，将抗原肽、B2M和HLA重链用柔性连接子串联表达。只有高亲和力肽能稳定折叠并运输到细胞表面，低亲和力肽则滞留在胞内。通过慢病毒转导将肽库与HLA等位基因库组合，利用流式细胞术按表面染色强度将细胞分选为四个bin，再对每个bin中的肽-HLA条形码进行深度测序，计算每个组合的E-score（呈递评分）。该方法绕过了内源性抗原加工途径，直接评估肽与HLA的结合稳定性，并通过在B2M中引入同义突变条形码实现多HLA等位基因的并行筛选。

图 1　Fig. 1。图1展示单链三聚体（SCT）设计原理和验证。a示意高亲和力肽使SCT运输到细胞表面，低亲和力肽则滞留在胞内。b流式显示高亲和力肽（红色）表面染色强，低亲和力肽（蓝色）与空白对照（灰色）无差异。c荧光成像显示高亲和力肽的eGFP定位于细胞膜，低亲和力肽则弥散在胞质。d显示多个HLA等位基因（A01:01、B07:02、C04:01、H2-Kb）均依赖高亲和力肽才能表面呈递。e显示gMFI与肽亲和力呈松散S形关系。f显示截短SCT不能表面呈递，但共表达可溶性肽可部分恢复。*

核心亮点

亮点 1｜ESCAPE-seq性能媲美NetMHC

在IEDB已知亲和力肽段上，ESCAPE-seq的E-score与实验亲和力高度相关（Pearson r=0.77），ROC-AUC达0.919，与NetMHC4相当。对于高亲和力肽，ESCAPE-seq召回率>90%。在HLA-A01:01、B07:02和C*04:01上均表现一致。引入Y84C二硫键突变后，相关性从0.49提升至0.77，提高了检测灵敏度和动态范围。

图 2　Fig. 2。图2展示ESCAPE-seq工作流程和性能验证。a示意从IEDB选择肽段构建SCT文库，转导细胞后分选测序。b流式直方图显示细胞按表面染色强度分为四个bin。c散点图显示E-score与IEDB亲和力相关性（r=0.77）。d显示ESCAPE-seq对高亲和力肽召回率>90%。e ROC曲线AUC=0.919。f PR曲线AUC=0.91。g-h显示在多个HLA等位基因上ESCAPE-seq与NetMHC4性能相当。

亮点 2｜揭示SARS-CoV-2变异株抗原呈递变化

对SARS-CoV-2刺突和核衣壳蛋白进行全蛋白tiling扫描，覆盖17个变异株的900个突变肽。ESCAPE-seq与NetMHC在训练肽上ROC-AUC为0.95，但在SARS-CoV-2新肽上显著下降，提示NetMHC对新肽预测能力有限。点突变常导致肽呈递状态改变，许多野生型不呈递的肽在突变后变为呈递，反之亦然，表明病毒变异可能通过改变抗原呈递实现免疫逃逸。

图 3　Fig. 3。图3展示SARS-CoV-2变异株抗原呈递筛选结果。a示意对刺突和核衣壳蛋白进行tiling肽段设计及变异株突变肽。b散点图显示ESCAPE-seq与NetMHC预测一致性，约90%肽两者均判定为不呈递。c显示ESCAPE-seq阳性肽的基序与已知HLA等位基因基序一致。d-e显示文献报道的SARS-CoV-2肽大多被ESCAPE-seq检出。f-g显示很少肽被多个HLA等位基因共同呈递。h-j显示点突变常改变肽的呈递状态。

亮点 3｜组合筛选实现多HLA并行分析

通过组合条形码策略，将986个MS来源肽与30个HLA等位基因同时筛选，覆盖29,000个pHLA组合。ESCAPE-seq捕获了超过80%的MS检测肽，部分等位基因达90%，ROC-AUC多在0.8-1.0之间。对于HLA-C等训练数据少的等位基因，ESCAPE-seq表现优于NetMHC4.1，证明了其在无偏HLA分析中的优势。

图 4　Fig. 4。图4展示组合ESCAPE-seq策略及大规模验证。a示意在B2M基因3'端引入同义突变条形码区分HLA等位基因。b显示用986个MS肽与30个HLA等位基因进行组合筛选。c显示ESCAPE-seq捕获MS肽的比例，多数等位基因>80%。d显示ROC-AUC多在0.8-1.0。e显示对92个驱动突变和31个融合基因的1,500个肽与50个HLA等位基因进行组合筛选。f显示spike-in对照肽的E-score与IEDB数据相关性好。g显示ESCAPE-seq发现NetMHC预测为不结合但实际呈递的肿瘤新抗原，尤其HLA-C限制性肽。

亮点 4｜发现跨人群共享的公共新抗原

对92个癌症驱动突变和31个高频融合基因的1,500个肽段，在50个HLA等位基因（覆盖>90%全球人群）中筛选75,000个组合。大多数肽仅被1-2个HLA等位基因呈递，但少数肽被≥20个等位基因呈递，称为“公共新抗原”。例如EGFR(T790M)的LTSTVQLIM肽被多个HLA-C等位基因呈递，且被独立MS实验验证。HLA-C等位基因整体呈递率高于HLA-B。

图 5　Fig. 5。图5展示癌症新抗原呈递景观。a热图显示1,500个癌基因肽在50个HLA等位基因上的E-score，呈中等程度聚类，无普遍呈递肽。b显示大多数肽仅被1-2个等位基因呈递，少数被≥20个等位基因呈递。c散点图显示被多个等位基因呈递的肽中，部分被MS实验验证。d-e显示不同突变在HLA等位基因上的呈递热点。g显示融合蛋白呈递差异大，EWSR1-FLI被近30个等位基因呈递，而PAX7-FOX仅被1个等位基因呈递。h显示不同突变的HLA兼容性差异，EGFR(T790M)被>60%等位基因呈递，而KRAS(G12C)仅2%。

亮点 5｜突变特异性呈递优先于野生型

比较突变肽与对应野生型肽的呈递模式，发现约一半的突变肽与野生型肽共同呈递，但存在大量仅突变肽呈递（Mut+）的情况。这些Mut+肽因野生型不呈递而可能逃避免疫耐受，是理想的免疫治疗靶点。例如KRAS(G12D)的GADGVGKSA被HLA-C08:02呈递，EGFR(T790M)的IMQLMPFGC被HLA-A02:01呈递。体外T细胞刺激实验证实Mut+肽能诱导多能性T细胞反应。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 单链三聚体（SCT）、慢病毒文库、流式分选、深度测序、组合条形码
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事肿瘤免疫、新抗原预测、HLA多态性研究或疫苗设计的科研人员。

带走一句

ESCAPE-seq将抗原呈递筛选从质谱的“发现”模式转变为DNA测序的“筛选”模式，可同时覆盖人群HLA多样性和突变谱，为肿瘤新抗原鉴定和疫苗设计提供高通量、无偏的工具。