IF46.9｜NIS-Seq：核内原位测序实现细胞类型无关的光学扰动筛选

NIS-Seq将光学扰动筛选拓展至任意有核细胞，突破转录活性和细胞体积限制。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

光学混合筛选（optical pooled screening）通过荧光显微镜将单细胞表型与遗传扰动关联，为富集式筛选提供了高通量替代方案。此前方法依赖胞质内原位测序检测内源表达的条形码mRNA，在转录活跃、体积较大的细胞系中效果良好。然而，对于转录活性低、胞质体积小或细胞密度高的样本，胞质信号弱且细胞边界模糊，导致条形码分配困难。NIS-Seq通过将反向噬菌体启动子插入sgRNA下游，利用T7聚合酶在核内从基因组DNA局部转录出大量RNA拷贝，再经滚环扩增和原位测序产生明亮核内信号，从而摆脱对细胞转录活性的依赖。

科学问题

卡在哪里： 现有光学混合筛选依赖胞质mRNA条形码，受限于细胞转录活性、胞质体积和细胞分割精度，难以应用于原代细胞、巨噬细胞及高密度培养体系，且无法在组织样本中实现条形码识别。

本文要回答： 开发一种细胞类型无关的光学扰动筛选方法，并在多种细胞系、原代人类巨噬细胞及人类皮肤组织中验证其可行性和筛选性能。

技术路线

作者主要用了：核内原位测序、CRISPR筛选、T7体外转录、滚环扩增、荧光显微成像、机器学习。

作者改造慢病毒载体，在sgRNA表达盒的聚合酶III终止子后插入反向T7启动子。感染细胞后，T7聚合酶从基因组DNA转录出大量sgRNA反向互补RNA，在核内形成明亮信号簇。随后通过逆转录、挂锁探针连接和滚环扩增，利用三色测序化学进行多达14轮原位测序，实现核内条形码解码。该设计不依赖内源转录，适用于任意有核细胞。作者先在8种细胞类型中验证信号强度和映射率，再在HeLa和THP1细胞中开展全基因组CRISPR筛选，并进一步应用于原代巨噬细胞和皮肤组织。

图 1　Fig. 1。图1展示NIS-Seq核心流程：在sgRNA下游插入反向T7启动子，T7转录产生核内RNA，经逆转录、挂锁连接和RCA后，通过三色测序化学进行14轮测序。对比8种细胞类型，NIS-Seq在巨噬细胞中产生明亮信号，而胞质原位测序几乎无信号。THP1细胞14轮测序图像显示核内信号随循环改变颜色组合，可解码为已知序列。映射率分析显示NIS-Seq在不同细胞类型中均高，且乱序文库映射率低。混合实验证明核分配特异性高，NIS-Seq与NGS定量高度相关。

核心亮点

亮点 1｜NIS-Seq在8种细胞类型中实现高效条形码映射

作者在包括THP1来源巨噬细胞和原代人类巨噬细胞在内的8种细胞类型中测试NIS-Seq，所有类型均获得明亮核内信号，而传统胞质原位测序在巨噬细胞中几乎无信号。14轮测序后，NIS-Seq在多种细胞中稳定映射至文库成员，映射率显著高于胞质方法，且使用乱序参考文库时映射率大幅下降，证明信号特异性。混合GFP阳性与NIS-Seq文库细胞实验显示核分配高度特异，两种固定方案下均无交叉污染。此外，NIS-Seq与PCR-NGS在69,525个文库成员的定量上高度相关，验证了其定量准确性。

图 2　Fig. 2。图2展示HeLa细胞中IL-1β刺激下的全基因组NIS-Seq筛选结果。火山图显示基因水平折叠变化，命中基因包括IL1R1、TRAF6、CHUK、IKBKG等。单细胞图像拼图显示靶向这些基因的细胞p65–mNeonGreen核转位减少。正交sgRNA验证了强效命中。TNF刺激的筛选结果类似，确认TNFRSF1A等通路成员。

亮点 2｜全基因组筛选揭示NF-κB通路关键基因

在HeLa–Cas9–p65–mNeonGreen细胞中，作者用76,441条sgRNA进行IL-1β和TNF刺激下的全基因组筛选，每个刺激下超过18,000个基因有至少10个细胞覆盖。通过计算p65–mNeonGreen与核染色信号的像素级Pearson相关系数量化核转位，FDR校正后鉴定出IL1R1、TNFRSF1A、TRAF6、CHUK、IKBKG等已知通路成员。单细胞图像拼图直观显示靶向这些基因的细胞核转位减少。使用TKOv3正交sgRNA验证了强效命中基因。结果与此前靶向光学筛选高度一致。

图 3　Fig. 3。图3展示THP1巨噬细胞中尼日利亚菌素和PrgI+PA刺激下的全基因组筛选。火山图显示NLRP3、IKBKB等为NLRP3通路关键基因，NLRC4、NAIP、ANTXR2为PrgI+PA通路必需。单细胞图像拼图显示命中基因的ASC斑点减少。正交sgRNA和克隆敲除细胞系的细胞因子分泌实验验证了命中基因功能。

亮点 3｜THP1巨噬细胞中解析NLRP3和NLRC4炎症小体组装

在THP1–ASC–GFP–CASP1/8DKO细胞中，作者分别用尼日利亚菌素和PrgI+PA激活NLRP3和NLRC4炎症小体，通过高频滤波GFP信号与总GFP信号比值量化ASC斑点形成。全基因组筛选确认NLRP3和IKBKB为NLRP3通路最关键的基因，IRAK1、HDAC5、CALCB、PPP2R4、RNF31等为中等效应基因；NLRC4、NAIP和ANTXR2为PrgI+PA通路必需，并发现ZBTB4、PAXIP1和LAMTOR家族成员参与。正交sgRNA和克隆敲除细胞系的细胞因子分泌实验验证了命中基因的功能。

图 4　Fig. 4。图4展示原代人类巨噬细胞中的混合光学筛选。载体图显示CROPseq-iT7共表达C1C–EGFP，VPX–VPR质粒提高转导效率。FACS显示30%转导效率，共聚焦成像显示C1C–EGFP在炎症小体激活时形成斑点。核转染SpCas9后NGS显示25–35%编辑效率。筛选结果火山图显示ANTXR2显著，NLRC4和NAIP不显著。阵列验证确认ANTXR2依赖、NLRC4非依赖的激活。

亮点 4｜原代人类巨噬细胞中实现混合光学筛选

作者改造CROPseq-iT7载体共表达C1C–EGFP报告子，并利用VPX–VPR提高慢病毒转导效率。原代M-CSF巨噬细胞转导效率达30%，EGFP报告子可自动量化炎症小体激活。通过核转染SpCas9蛋白实现25–35%的等位基因编辑效率。利用28条sgRNA靶向THP1筛选命中的5个基因进行混合筛选，发现ANTXR2是PrgI+PA的进入受体，效应大小与编辑效率匹配，但NLRC4和NAIP扰动未增加未激活细胞频率。阵列验证确认ANTXR2依赖、NLRC4非依赖的炎症小体激活，提示原代巨噬细胞中存在不同于THP1的激活机制。

图 5　Fig. 5。图5展示人类皮肤组织中的NIS-Seq。流程图显示表皮片制备、慢病毒转导和NIS-Seq步骤。6轮测序图像显示核内信号在组织z轴上的分布，F-actin染色确认组织完整性。与乱序对照相比，NIS-Seq信号特异性映射至sgRNA文库，未转导对照无信号。

亮点 5｜人类皮肤组织中实现条形码原位识别

作者将人表皮片用携带28条sgRNA的慢病毒文库转导，在漂浮状态下进行NIS-Seq。6轮测序后，通过图像旋转和平移映射细胞，F-actin染色确认组织完整性。与乱序对照文库相比，NIS-Seq信号特异性映射至sgRNA文库，未转导对照组织无信号。尽管组织柔性导致局部扭曲伪影，但结果证明NIS-Seq可在原代人类组织中实现条形码识别，为生理相关遗传扰动筛选铺平道路。

亮点 6｜零知识机器学习分析发现RELA新表型

作者使用未在细胞图像上训练过的SwinV2-T模型，对712,146张IL-1β刺激的HeLa单细胞图像提取768维嵌入向量。UMAP可视化显示邻近细胞具有高度视觉相似性。聚类分析发现扰动基因在簇中分布不均，排名前三的基因包括已知通路成员RELA。值得注意的是，RELA扰动虽未改变DNA-p65相关性指标，但零知识分析将其映射至p65报告子表达显著下调的簇。这一方法无需先验知识即可探索功能扰动细胞，为大规模光学筛选数据解读提供了新途径。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 核内原位测序、CRISPR筛选、T7体外转录、滚环扩增、荧光显微成像、机器学习
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事CRISPR筛选、单细胞成像、免疫学或组织生物学研究的科研人员。

带走一句

NIS-Seq将光学扰动筛选从细胞系拓展至原代细胞和组织，为免疫学、发育生物学等领域提供了高密度、高复杂度的遗传筛选工具，且无需依赖细胞转录活性。