IF50.5｜疟原虫RIFIN蛋白结合KIR2DL1与KIR2DS1调控NK细胞

疟原虫表面RIFIN蛋白同时结合抑制性和激活性KIR受体，双向调控NK细胞功能。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

恶性疟原虫感染的红细胞表面表达RIFIN蛋白家族，其中部分成员可结合抑制性免疫受体如LILRB1和LAIR1，从而抑制NK细胞功能，帮助寄生虫逃避免疫清除。KIR受体家族包含抑制性和激活性成对受体，胞外结构域高度相似但胞内信号相反。抑制性KIR通过识别HLA I类分子介导“缺失自我”识别，而激活性KIR的病原体来源配体一直未被发现。此前研究表明RIFIN与LILR、LAIR等抑制性受体结构相似，提示RIFIN可能也结合KIR受体。

科学问题

卡在哪里： 尽管已知RIFIN可结合LILRB1和LAIR1等抑制性受体，但尚无任何病原体来源的配体被证实可结合人类激活性KIR受体。激活性KIR在感染中的生物学功能仍停留在假说阶段，缺乏实验证据。

本文要回答： 鉴定能够结合抑制性KIR2DL1的RIFIN蛋白，并探究其是否也能结合同源激活性受体KIR2DS1，从而揭示激活性KIR在疟疾免疫中的潜在作用。

技术路线

作者主要用了：流式细胞分选、RIFIN表达文库、系统发育分析、表面等离子共振、X射线晶体学、NK细胞功能实验。

作者首先用流式细胞术筛选泰国田间分离株感染的iRBC与抑制性KIR-Fc融合蛋白的结合，发现Lek174株中5.4%的iRBC结合KIR2DL1-Fc。通过分选富集结合细胞并克隆其RIFIN可变区，获得RBK21。随后构建3D7株全RIFIN表达文库，经两轮分选和扩增子测序鉴定出16个候选KIR2DL1结合RIFIN，系统发育分析显示它们聚为一个进化枝。进一步在非洲田间株基因组中预测并验证了该进化枝的保守性。最后通过结构生物学和NK细胞功能实验阐明结合机制及信号转导效应。

图 1　Fig. 1。图1展示了KIR2DL1结合RIFIN的鉴定流程。a图流式分选显示Lek174-iRBC中5.4%结合KIR2DL1-Fc，分选后富集至更高比例。b图显示嵌合RBK21和全长RBK21转基因iRBC均显著结合KIR2DL1-Fc，MFI远高于亲本3D7。c图为RIFIN表达文库构建示意图，将可变区插入pFCEN_rif质粒保守区之间。d图显示两个文库中KIR2DL1-Fc阳性iRBC比例分别为2.13%和1.63%。e图系统发育树显示16个候选RIFIN中10个聚为同一进化枝，RBK21也位于该枝内。

核心亮点

亮点 1｜KIR2DL1结合RIFIN的发现与验证

通过流式分选从泰国田间株Lek174中富集到结合KIR2DL1-Fc的iRBC，克隆出单一RIFIN可变区cDNA，命名为RBK21。转染RBK21全长或嵌合RIFIN的转基因寄生虫均能结合KIR2DL1-Fc。构建3D7株全RIFIN表达文库（覆盖150/153个可变区），经两轮分选和测序，在两个生物学重复中共同鉴定出16个候选RIFIN，其中10个属于同一进化枝。进一步对17个该进化枝成员进行转基因表达验证，14个能结合KIR2DL1。

图 2　Fig. 2。图2展示了KIR2DL1结合RIFIN的保守性和结构基础。a图系统发育树显示泰国Lek174和Lek79株的KIR2DL1结合RIFIN与3D7株聚为同一进化枝。b图显示非洲pfKE01和pfSN01株中与3D7 KIR2DL1结合RIFIN聚类的进化枝。c图SPR结果显示肯尼亚和塞内加尔田间株RIFIN与KIR2DL1的结合亲和力。d图展示RBK21-KIR2DL1复合物结构，RIFIN结合在KIR2DL1的D1结构域，与HLA-Cw4结合位点不重叠。e图显示RIFIN与KIR2DL1的相互作用细节。f图SPR显示RBK21 S221R突变体完全丧失结合能力。

亮点 2｜KIR2DL1结合RIFIN在田间株中保守

对泰国Lek174和Lek79株构建RIFIN表达文库并筛选，分别获得12和16个可变区序列，其中6和12个归入与3D7相同的KIR2DL1结合进化枝。对非洲肯尼亚pfKE01和塞内加尔pfSN01株的全RIFIN进行系统发育分析，预测出与3D7 KIR2DL1结合RIFIN聚类的进化枝（分别含14和8个RIFIN）。选取代表成员进行SPR验证，肯尼亚5个表达蛋白中4个结合KIR2DL1，塞内加尔4个表达蛋白中3个结合KIR2DL1。KIR2DL1结合RIFIN约占各株RIFIN库的10%，提示其保守性和进化保留。

图 3　Fig. 3。图3展示了RIFIN通过KIR2DL1的抑制信号功能。a图NFAT-GFP报告细胞中，RBK21表达的iRBC诱导41.5% GFP阳性，而亲本3D7仅0.41%。b图流式门控策略显示KIR2DL1阳性NK细胞分选。c-e图显示K562-RBK21显著抑制KIR2DL1阳性NK细胞的CD107a表达、IFNγ和TNF产生，而对照RIFIN无抑制。f图细胞毒性实验显示RBK21表达K562被KIR2DL1阳性NKL细胞杀伤减少。g-i图支持脂双层实验显示RBK21和KEN-01被招募到免疫突触并减少穿孔素沉积，而非结合突变体无此效应。

亮点 3｜RIFIN-KIR2DL1复合物结构解析

解析了RBK21和KEN-01与KIR2DL1的复合物晶体结构（分辨率分别为2.89 Å和2.17 Å）。RIFIN可变区为螺旋束，通过两个螺旋和两个环接触KIR2DL1的D1结构域，结合位点围绕保守疏水核心（L224和F242嵌入KIR2DL1的L59、Y101、V111疏水口袋），并由分子间β-片层稳定。RIFIN与MHC I类分子在KIR2DL1上的结合位点不重叠。RBK21的S221R突变完全消除结合，但不影响折叠。KIR2DL1的177个等位基因中仅4个接触RIFIN，其中V111F突变不影响结合亲和力。

图 4　Fig. 4。图4展示了RIFIN与KIR2DS1的结合及激活功能。a图序列比对显示KIR2DL1的RIFIN结合残基在KIR2DS1中高度保守。b图结构叠加显示KIR2DS1同源模型与KIR2DL1的RIFIN结合表面几乎一致。c图SPR显示KIR2DS1以1.7 μM亲和力结合RBK21，而其对HLA-Cw4亲和力弱10倍以上。d图流式显示RBK21转基因iRBC结合KIR2DS1-Fc。e图NFAT-GFP报告细胞中RBK21诱导31.9% KIR2DS1报告细胞表达GFP。f-i图原代KIR2DS1阳性NK细胞与RBK21-iRBC共培养后CD107a、IFNγ和TNF显著升高。

亮点 4｜RIFIN通过KIR2DL1传递抑制信号

利用NFAT-GFP报告细胞系，RBK21表达的iRBC诱导41.5%的KIR2DL1报告细胞表达GFP，而亲本3D7仅0.41%。在原代NK细胞中，K562-RBK21显著抑制KIR2DL1阳性NK细胞的CD107a表达（从72.6%降至30.5%）、IFNγ产生（从40.1%降至5.4%）和TNF产生（从24.2%降至3.8%），且该抑制依赖于KIR2DL1。在支持脂双层实验中，RBK21和KEN-01被招募到免疫突触并显著减少穿孔素沉积，而非结合突变体RBK21S221R无此效应。

亮点 5｜RIFIN结合并激活KIR2DS1

结构比对显示KIR2DL1的RIFIN结合残基在KIR2DS1中几乎完全保守（仅V111L替换）。SPR测得KIR2DS1以1.7 μM亲和力结合RBK21，接近KIR2DL1的0.5 μM，而KIR2DS1对HLA-Cw4的亲和力弱10倍以上。所有测试的KIR2DL1结合RIFIN均能结合KIR2DS1。在NFAT-GFP报告细胞中，RBK21诱导31.9%的KIR2DS1报告细胞表达GFP。原代KIR2DS1阳性NK细胞与RBK21表达的iRBC共培养后，CD107a表达升至82.1%，IFNγ和TNF产生分别升至29.4%和27.8%，显著高于对照。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 流式细胞分选、RIFIN表达文库、系统发育分析、表面等离子共振、X射线晶体学、NK细胞功能实验
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 研究疟疾免疫、NK细胞生物学或KIR受体功能的科研人员，以及关注病原体-宿主互作的结构生物学家。

带走一句

激活性KIR受体可识别病原体表面蛋白，提示在分析NK细胞相关免疫数据时，需考虑病原体配体对激活性受体的直接激活作用，而不仅限于HLA I类分子。