IF46.9｜人肝机器灌注下单细胞解析AAV衣壳嗜性与分区

AAV-LK03在正常人肝中高效特异转导门静脉周肝细胞，脂肪变性改变衣壳分区偏好。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

AAV载体已在血友病A/B基因治疗中获批，但多数肝病需转导约40%肝细胞，现有衣壳在安全剂量下难以达到。AAV衣壳的肝细胞嗜性存在物种差异，啮齿类和NHP研究高估疗效，人源化小鼠模型结果矛盾。临床试验数据受剂量、启动子、生产方法等混杂因素影响，且缺乏肝活检数据，难以比较衣壳性能。因此，亟需在接近临床条件下系统评估AAV衣壳在人肝中的转导效率和特异性。

科学问题

卡在哪里： 此前AAV衣壳筛选依赖动物模型或人源化小鼠，无法准确反映人肝微环境；唯一的人肝NMP研究存在单例、炎症、未排除中和抗体、仅bulk分析等缺陷，无法提供可靠衣壳优先级。

本文要回答： 在生理条件下维持的正常和脂肪变性人肝中，以单细胞分辨率比较AAV5/6/8/LK03/NP59的转导效率、特异性及分区偏好。

技术路线

作者主要用了：NMP、scRNA-seq、流式、ddPCR、ISH、表位体定量。

作者用OrganOx metra系统对人肝进行长期NMP，优化灌注液、抗凝剂和血液洗涤以去除中和抗体。构建scAAV-CMV荧光蛋白载体，将五种AAV衣壳载体共注入正常或脂肪变性人肝，48小时后分离肝细胞和非实质细胞，通过scRNA-seq、流式、ddPCR和ISH在单细胞水平比较转导效率、细胞类型特异性和肝细胞分区偏好，并分析表位体形成动力学。

图 1　Fig. 1。图1展示NMP系统设置和AAV8在正常肝中的转导。a-b显示插管和载体注入；c显示NL1/NL2灌注期间乳酸、pH等指标稳定；d-e的UMAP和热图显示AAV8主要转导肝细胞，也转导内皮和单核/巨噬细胞；f-j通过免疫染色、流式、ddPCR和ISH验证scRNA-seq结果，并显示剂量依赖性转导。

核心亮点

亮点 1｜AAV-LK03肝细胞转导最优

在正常和脂肪变性人肝中，AAV-LK03对肝细胞的功能转导效率（mRNA和蛋白）最高，达27.7%，显著高于AAV-NP59（约55%更低）、AAV8、AAV6和AAV5。AAV-LK03对非实质细胞转导极少，特异性最佳。物理转导（DNA）效率以AAV6最高，但转录效率AAV-LK03最高，提示衣壳影响载体转录。该结果与人源化小鼠模型相反，凸显人肝NMP平台的价值。

图 2　Fig. 2。图2比较五种AAV衣壳在四个肝中的转导。a显示衣壳分配；b-c的UMAP显示细胞类型和转导细胞；d热图显示AAV-LK03对肝细胞特异性最高；e-i显示AAV-LK03功能转导效率最高，AAV6物理转导最高；j显示AAV-LK03转录效率最高。

亮点 2｜衣壳特异性肝细胞分区

AAV-LK03和AAV8在正常肝中偏好门静脉周肝细胞，AAV5在脂肪变性肝中偏好中央静脉周肝细胞。AAV-LK03的强门静脉周分区在脂肪变性中丧失，AAV5的中央静脉周分区仅在脂肪变性中出现。ISH证实这些分区模式，且与已知AAV受体表达无关。该发现对靶向特定代谢分区疾病的基因治疗具有指导意义。

图 3　Fig. 3。图3分析肝细胞分区和脂肪变性对转导的影响。a显示分区和脂肪变性模块评分；b-d密度图显示AAV8/LK03门静脉周偏好，AAV5在脂肪变性中中央静脉周偏好；e-g的ISH证实AAV5在脂肪变性中靶向脂质堆积的中央静脉周肝细胞，AAV-LK03在正常肝中门静脉周分布。

亮点 3｜脂肪变性损害表位体形成

脂肪变性人肝中AAV载体环状表位体数量减少，且AAV8和AAV-LK03的连环化受损，而AAV5主要形成环状单体且连环化延迟。在棕榈酸处理的iPS-Hep中重现该现象。AAV5表位体在人源化小鼠中随时间降解，转录效率最低。脂肪变性可能通过氧化应激抑制DNA修复通路，影响ITR重组，提示脂肪肝患者基因治疗持久性可能降低。

图 4　Fig. 4。图4展示表位体形成分析。a示意PS-DNase和限制酶处理区分环状单体和连环体；b-c显示人肝中环状单体和连环体数量；d显示脂肪变性肝中表位体减少；e-g显示棕榈酸处理iPS-Hep中AAV8/LK03连环化受损，AAV5不受影响；h-j显示人源化小鼠中AAV5表位体降解快，连环化延迟。

亮点 4｜非实质细胞嗜性揭示新靶点

AAV5和AAV8高效转导肝窦内皮细胞（LSEC），在脂肪变性肝中AAV5转导效率是AAV8的3.3-5倍。AAV6和AAV8高效转导Kupffer细胞，AAV-LK03几乎不转导。LSEC是FVIII生理来源，靶向LSEC可避免肝细胞表达FVIII的未折叠蛋白反应，为血友病A和血管性血友病提供更生理的靶细胞。

图 5　Fig. 5。图5展示非实质细胞嗜性。a-b单核/巨噬细胞亚群及分布；c-d显示AAV6和AAV8高效转导Kupffer细胞；e定量Kupffer细胞转导；f-g内皮细胞亚群；h-i显示AAV5和AAV8主要转导LSEC，脂肪变性中AAV5更优；j定量LSEC转导。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： NMP、scRNA-seq、流式、ddPCR、ISH、表位体定量
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事AAV基因治疗、肝病单细胞分析及临床转化研究的科研人员。

带走一句

人肝NMP结合单细胞多组学可精准筛选AAV衣壳，为临床基因治疗提供直接证据，避免动物模型误导。