IF50.5｜定制化冠状病毒受体：不依赖天然受体建立感染模型

模块化设计人工受体，让无已知受体的冠状病毒也能在体外高效感染和培养。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

冠状病毒进入细胞依赖刺突糖蛋白（S）与宿主受体的结合。目前已明确的蛋白受体仅有ACE2、APN、DPP4、CEACAM1a和TMPRSS2等少数几种，但大量蝙蝠来源的冠状病毒受体未知，导致无法建立感染模型，严重阻碍了病毒分离、培养、致病机制研究以及疫苗和抗病毒药物开发。传统受体鉴定耗时且成功率低。已有研究表明，通过抗体或替代受体可实现不依赖天然受体的病毒进入，但效率低且机制不清。因此，亟需一种通用策略，在不依赖天然受体的情况下为冠状病毒建立功能性感染模型。

科学问题

卡在哪里： 此前缺乏对受体功能关键序列和结构要求的系统认识，无法理性设计功能性人工受体。抗体介导的非天然进入效率低，且不清楚哪些表位能诱导刺突蛋白构象变化以触发膜融合。

本文要回答： 开发一种模块化定制病毒受体（CVR）策略，通过组合人工受体支架和病毒结合域，为多种无已知受体的冠状病毒建立高效感染模型。

技术路线

作者主要用了：模块化蛋白设计、噬菌体展示、假病毒系统、冷冻电镜、细胞融合实验。

作者首先以ACE2为模型，逐步截短并替换其结构域，发现ACE2可被完全替换，并鉴定出最佳跨膜域和胞内域组合。随后，他们系统测试了不同病毒结合域（VBD）类型和支架模块，确立了模块化设计原则。利用该策略，他们为12种冠状病毒定制了受体，并通过假病毒、细胞融合和活病毒实验验证其功能。

图 1　Fig. 1 |。图1展示了ACE2结构域逐步截短和替换对受体功能的影响。随着ACE2锚定部分缩短，假病毒进入效率下降，但132aa短片段仍保留约0.5%功能。用其他蛋白结构域替换后，特别是Mxra8跨膜域和EPM的加入，可恢复甚至增强进入效率。该图确立了模块化设计的基本框架。

核心亮点

亮点 1｜ACE2可被完全替换

通过逐步截短ACE2并替换其结构域，作者发现即使仅保留132个氨基酸的短片段仍能支持低水平病毒进入（约0.5%）。进一步用其他蛋白的跨膜域和胞内域替换后，受体功能得以维持甚至增强。其中，来自Mxra8的跨膜和胞内域组合表现最佳，加入内吞预防基序（EPM）可提高细胞表面定位和进入效率。这些结果表明ACE2并非不可替代，为完全人工受体设计奠定了基础。

图 2　Fig. 2 |。图2通过热图展示了44个scFv-CVR的假病毒进入效率。靶向RBM附近表位的CVR大多高效，而靶向封闭构象表位的CVR无效。S2L20-CVR（NTD表位）意外高效。功能性CVR能诱导76E1表位暴露和S2'切割，表明其通过触发构象变化激活融合。

亮点 2｜功能性表位图谱揭示关键机制

作者将22个已知中和抗体的scFv嫁接到受体支架上，发现靶向RBM附近表位（位点i、ii、iii）的CVR能高效支持病毒进入，而靶向封闭构象表位的CVR则无效。意外的是，靶向NTD的S2L20-CVR也能促进高效进入。功能性CVR能诱导76E1表位暴露和S2'位点切割，表明其通过触发刺突蛋白构象变化激活膜融合。这为CVR设计提供了表位选择依据。

图 3　Fig. 3 |。图3聚焦S2L20-CVR介导的NTD进入机制。S2L20-CVR支持多种沙贝病毒进入，但N370糖基化会干扰。冷冻电镜结构显示S2L20结合后RBD全部打开，分子棘轮机制阻止关闭。该图揭示了NTD结合也能触发RBD开放，从而激活膜融合。

亮点 3｜NTD介导的进入机制

S2L20-CVR靶向NTD却能高效支持SARS-CoV-2及多种变异株和沙贝病毒的进入。冷冻电镜结构显示，S2L20结合后诱导三个RBD全部处于“up”构象，并通过分子棘轮机制阻止RBD关闭。N370糖基化会干扰S2L20结合，去除该糖基可增强RaTG13和BANAL-20-52的进入。这表明NTD结合也能触发RBD开放，从而激活融合机器。

图 4　Fig. 4 |。图4展示了CVR策略的广泛适用性。系统发育树显示12种冠状病毒（多数无已知受体）的CVR均能高效支持假病毒进入和细胞融合。HKU1特异性2D1-CVR与TMPRSS2功能相当。更重要的是，CVR支持RsHuB2019A和HKU5活病毒的繁殖、拯救和分离。

亮点 4｜CVR策略的广泛适用性

作者为12种冠状病毒（涵盖6个亚属）定制了受体，其中大多数无已知受体。通过噬菌体展示筛选纳米抗体，构建的CVR使假病毒进入效率提高102-104倍。HKU1特异性2D1-CVR与天然受体TMPRSS2功能相当。此外，CVR支持MHV和229E活病毒扩增，并成功拯救和分离了HKU5毒株。

亮点 5｜支持活病毒繁殖与分离

利用CVR表达细胞，作者成功繁殖了复制型VSV重组病毒（携带HKU3或HKU5 S基因），并观察到合胞体形成和RNA积累。更重要的是，Caco2-Nb27细胞支持了ACE2非依赖的蝙蝠沙贝病毒RsHuB2019A的高效繁殖，即使在低MOI和无胰蛋白酶条件下也能产生细胞病变。此外，利用Caco2-1B4细胞成功拯救了野生型HKU5-1和携带报告基因的HKU5-ZGH，并从蝙蝠样本中分离到HKU5毒株。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 模块化蛋白设计、噬菌体展示、假病毒系统、冷冻电镜、细胞融合实验
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事冠状病毒研究、病毒受体鉴定、抗病毒药物筛选和疫苗评价的科研人员。

带走一句

模块化设计人工受体可绕过天然受体限制，为难以培养的病毒建立感染模型，加速病毒学研究和抗病毒药物开发。