IF31.7｜碱基编辑引入三核苷酸重复中断，抑制HD和FRDA体细胞扩增

用CBE和ABE在致病重复序列中制造天然中断，显著降低小鼠CNS中的重复扩增。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

三核苷酸重复（TNR）疾病是一类由特定重复序列异常扩增引起的神经退行性疾病，包括亨廷顿病（HD）和弗里德赖希共济失调（FRDA）。HD由HTT基因中CAG重复扩增导致，FRDA则由FXN基因内含子中GAA重复扩增引起。重复序列长度是决定发病年龄和严重程度的主要因素，且长重复在体细胞中不稳定，会随年龄进一步扩增。已有研究表明，天然存在的重复中断（如CAG中的CAA、GAA中的GAG/GGA）能稳定重复序列，延缓或阻止疾病发生。然而，如何主动在致病重复序列中引入此类中断尚未实现。

科学问题

卡在哪里： 虽然已知重复中断对TNR疾病有保护作用，但缺乏在患者细胞和动物体内直接引入中断的方法。此前基因编辑策略多针对单个基因或突变，无法高效处理长重复序列，且对全基因组脱靶效应的评估不足。

本文要回答： 利用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器在HD和FRDA相关重复序列中引入天然中断，评估其对重复稳定性和疾病表型的影响。

技术路线

作者主要用了：CBE、ABE、AAV9递送、CIRCLE-seq、WGS、HTS、ddPCR、小鼠模型。

作者首先在HEK293T细胞中优化针对CAG和GAA重复的碱基编辑策略，筛选高效且副产物少的编辑器变体。随后在患者来源成纤维细胞中验证编辑效果及对重复扩增的影响。进一步通过AAV9载体将编辑器递送至HD和FRDA小鼠模型，在体内评估编辑效率、重复长度变化及脱靶效应。同时利用CIRCLE-seq和全基因组测序系统分析脱靶位点，评估安全性。

图 1　Fig. 1。图1展示了CAG-CBE的设计和优化。a-c为策略示意图，d-e显示不同脱氨酶和连接子的编辑效率与纯度，EA-evoA-32NLS表现最佳。f显示HD患者成纤维细胞中编辑效率达66-82%，且长等位基因编辑更高。g-h显示编辑后细胞在30天内未出现重复扩增，而对照组重复长度增加。

核心亮点

亮点 1｜CAG-CBE高效引入CAA中断

在HEK293T细胞中，EA-evoA-32NLS编辑器结合sgCTG实现64%的HTT等位基因编辑，且副产物少。在HD患者成纤维细胞中，编辑效率达66-82%，且长致病等位基因编辑效率更高。编辑后的细胞在30天培养中未出现重复扩增，而对照组重复长度增加约6个CAG。

图 2　Fig. 2。图2呈现CAG-CBE的全基因组脱靶分析。a显示在多个TNR疾病相关基因中编辑效率为39-65%。b为CIRCLE-seq鉴定的脱靶位点分类，c-e显示编辑频率随错配数增加而降低。f-g为HTS验证结果，与WGS一致。h显示编辑主要发生在非编码区，蛋白编码区多为同义突变。

亮点 2｜全基因组脱靶分析揭示安全性

CIRCLE-seq鉴定出5706个潜在脱靶位点，WGS验证其中48%发生编辑。编辑主要发生在非编码区或同义突变位点，仅6.1%的脱靶位点位于蛋白编码区，且大多数为良性错义突变。GAA-ABE的脱靶位点更多（41992个），但>97%位于非编码区，蛋白编码区仅83个位点受影响。

图 3　Fig. 3。图3展示AAV9-CBE在HD小鼠中的效果。a为双AAV载体设计，b为注射方案。c显示皮层和纹状体转导效率分别为50%和31%。d显示编辑效率随时间增加，24周时皮层达34%。e-f显示GFP阳性细胞中编辑效率更高。g-j显示治疗组CAG不稳定指数显著降低，表明重复扩增被抑制。

亮点 3｜AAV9递送在HD小鼠中减少CAG扩增

新生Htt.Q111小鼠ICV注射AAV9-CBE后，皮层和纹状体编辑效率随时间增加，24周时分别达34%和26%。在GFP阳性细胞中编辑效率更高（76%和72%）。治疗组皮层和纹状体的CAG不稳定指数显著降低，表明重复扩增被抑制且出现收缩。

图 4　Fig. 4。图4展示GAA-ABE的设计和优化。a为策略示意图，b显示不同ABE变体在HEK293T细胞中的编辑效率，ABE8e-dNRCH表现最佳。c显示在mESC中编辑效率随重复长度增加而提高。d-e为CIRCLE-seq鉴定的脱靶位点，f-h显示编辑频率随错配数增加而降低。

亮点 4｜GAA-ABE恢复FRDA细胞FXN表达

在FRDA患者成纤维细胞中，GAA-ABE编辑效率达32-33%，且编辑后FXN mRNA水平从野生型的49%升至74%。编辑主要产生GAG和GGA中断，模拟天然保护性变异。

图 5　Fig. 5。图5展示GAA-ABE在FRDA患者细胞和小鼠中的效果。a-b显示患者成纤维细胞中编辑效率达32-33%，且与重复长度正相关。c显示编辑后FXN mRNA水平显著升高。d-e为AAV9-ABEdCH注射方案，f显示小鼠皮层编辑效率。g-j显示治疗组GAA不稳定指数显著降低，且长等位基因收缩更明显。

亮点 5｜AAV9-ABE在FRDA小鼠中减少GAA扩增

YG8s小鼠注射AAV9-ABEdCH后，皮层GAA重复编辑效率在YG8s.300和YG8s.800中分别达28%和55%。治疗组GAA不稳定指数显著降低，且长等位基因收缩更明显，表明编辑有效抑制体细胞扩增。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CBE、ABE、AAV9递送、CIRCLE-seq、WGS、HTS、ddPCR、小鼠模型
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事基因编辑、神经退行性疾病或重复序列稳定性研究的科研人员。

带走一句

碱基编辑可在长重复序列中高效引入天然中断，为TNR疾病提供了一种不依赖基因敲除的稳定化策略，但需关注全基因组脱靶效应。