IF36.1｜SUM-seq实现百万细胞级单细胞染色质与RNA联合测序

一种超高通量单细胞多组学方法，可同时解析染色质可及性与基因表达，揭示基因调控动态。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

大多数疾病相关遗传变异位于非编码区，而许多疾病的核心是转录因子（TF）驱动的基因调控紊乱，包括细胞分化失衡。因此，研究疾病机制需要能在单细胞分辨率下联合分析增强子与基因调控动态的技术。单细胞RNA测序（snRNA-seq）和单细胞ATAC测序（snATAC-seq）已极大推动了对细胞状态和扰动响应的理解，多模态分析更能揭示基本生物过程的基因调控动态。然而，现有单模态方法虽具备一定可扩展性，但多数多组学方法在通量、样本多重化能力或成本效益上存在局限，难以满足大规模时间进程或扰动筛选的需求。

科学问题

卡在哪里： 当前多组学方法如10x Multiome和ISSAAC-seq通量有限，SHARE-seq和Paired-seq虽提升细胞数但牺牲数据复杂度，MultiPerturb-seq虽支持多重化但整体可扩展性仍不足。缺乏一种能同时实现超高通量（百万级细胞）、多样本多重化（数百个样本）且成本可控的单细胞染色质与RNA联合分析技术。

本文要回答： 开发一种超高通量、多样本多重化的单细胞多组学测序方法，并验证其在解析巨噬细胞极化、T细胞分化和CRISPR扰动筛选中的基因调控动态。

技术路线

作者主要用了：组合索引、微流控、Tn5转座、逆转录、WNN、GRaNIE、chromVAR、MOFA、LDSC。

SUM-seq结合组合流体索引与单重多组学方法ISSAAC-seq，通过两步组合索引策略实现多样本标记。首先分离并固定细胞核，分装到多个孔中，分别对ATAC和RNA模态引入样本索引（Tn5转座和barcoded oligo-dT引物逆转录）。随后混合所有样本，进行cDNA-mRNA杂交体tagmentation以引入引物结合位点，再将细胞核过载到微流控系统（如10x Chromium）中，使每个液滴包含多个细胞核，通过液滴条形码实现单细胞分辨。最后破乳、预扩增并拆分文库进行模态特异性扩增。该设计允许在单个10x通道中处理数十万细胞核和数十个样本，大幅提升通量并降低成本。

图 1　Fig. 1。图1展示SUM-seq工作流程和性能基准。a为方法示意图，包括核分离、固定、样本索引引入、混合、微流控过载和文库构建。b为计算分析流程。c和d为人鼠混合实验的物种混合图，显示ATAC和RNA模态的碰撞率极低。e比较了SUM-seq与其他方法的复杂度指标。f显示过载液滴中数据质量不受影响。g表明SUM-seq聚合数据与ENCODE bulk数据高度一致。

核心亮点

亮点 1｜SUM-seq实现百万级细胞通量与多样本多重化

SUM-seq通过两步组合索引策略，在单个10x Chromium通道中实现约150万细胞和数百个样本的多组学分析。在人鼠混合实验中，使用16个样本索引加载10万细胞核，获得约1.4万高质量双模态细胞，碰撞率低至0.1%（RNA）和3.8%（ATAC）。与现有超高通量方法相比，SUM-seq在基因数和峰内片段数等复杂度指标上表现更优，且过载液滴中的细胞核数据质量与单核液滴相当。此外，该方法兼容甘油冻存，支持异步采样。

图 2　Fig. 2。图2展示巨噬细胞极化实验设计和多组学分析结果。a为实验流程，包括M1和M2极化时间点。b为WNN UMAP，显示细胞沿极化轨迹分离。c为M1和M2特征基因的AUCell评分。d和e为MOFA因子与极化轨迹的关联。f和g为各因子的通路富集。h和i为M1和M2极化过程中关键TF motif活性的动态变化，突出STAT1同源二聚体与ISGF3的转换。

亮点 2｜巨噬细胞极化中STAT1从同源二聚体转向ISGF3复合物

在hiPS来源巨噬细胞M1极化时间过程中，SUM-seq捕获了染色质可及性和基因表达的动态变化。MOFA分析识别出早期、持续和晚期响应因子。chromVAR motif活性显示，STAT1同源二聚体（STAT1.0）在早期响应中短暂升高后下降，而ISGF3复合物（STAT1.1、STAT2、IRF9）的motif活性在持续响应中逐渐增加。GRaNIE推断的eGRN进一步证实，STAT1 regulon活性与ISGF3 motif活性高度相关，而与STAT1.0 motif活性不相关。该发现揭示了IFN-γ刺激后从STAT1同源二聚体介导的染色质重塑向ISGF3驱动的I型干扰素响应的转变。

图 3　Fig. 3。图3展示eGRN分析和GWAS整合结果。a为GRN可视化，显示TF及其靶基因。b为STAT1和NFKB1的motif活性与regulon活性沿M1持续响应因子的变化。c为STAT1 regulon活性与STAT1.0和STAT1.1 motif活性的相关性散点图。d为STAT1.0与ISGF3 regulon的靶基因重叠。e为STAT1同源二聚体与ISGF3活性时间线模型。f为eGRN和ISGF3 regulon峰的LDSC富集结果。g为疾病相关基因沿M1持续响应因子的表达活性。h为rs4810485所在峰与CD40等基因的连接。

亮点 3｜eGRN整合GWAS揭示ISGF3调控网络与自身免疫病相关

利用GRaNIE构建的eGRN包含44个TF，其中IRF1和IRF8 regulon共享728个靶基因。通过LDSC分析，eGRN峰在炎症性肠病（IBD）、溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩病（CD）、花粉热和多发性硬化等免疫疾病中显著富集遗传力。进一步聚焦ISGF3 regulon（1,673个峰），自身免疫病富集仍然显著。将GWAS显著SNP映射到ISGF3靶基因，优先化了19个IBD、16个CD和37个嗜酸性粒细胞计数相关基因。例如，rs4810485位于CD40内含子，与IBD、CD和UC相关，且该峰被ISGF3调控，连接了M1极化与遗传风险。

图 4　Fig. 4。图4展示原代T细胞分化实验和结果。a为实验流程，包括naive CD4+ T细胞分离、亚群分化和刺激。b为WNN UMAP，按亚群和供体着色，显示供体2的iTreg与Th17重叠。c为各亚群特征基因的AUCell评分。d为TF motif活性热图，区分刺激响应性和亚群特异性TF。

亮点 4｜SUM-seq解析原代T细胞亚群特异性调控网络

对来自3名健康供体的原代CD4+ T细胞进行Th亚群分化（Th0、iTreg、Th2、Th1、Th17、IFN-β），并在未刺激和PMA/离子霉素再刺激条件下进行SUM-seq。共获得48,153个高质量细胞核。WNN UMAP显示各亚群分离，但供体2的iTreg与Th17聚类重叠，提示个体免疫特征影响分化。chromVAR分析识别出刺激响应性TF（如AP-1家族）和亚群特异性TF（如iTreg的SMAD2/3/4、NR4A1/2，Th2的GATA3，Th1的STAT4，Th17的BATF和MAF，IFN-β的STAT1/2和IRF家族）。这些结果与已知T细胞生物学高度一致，验证了SUM-seq在原代细胞中的可靠性。

图 5　Fig. 5。图5展示阵列CRISPR筛选实验设计和结果。a为实验流程，包括CRISPRi/a细胞系构建、分化和SUM-seq。b和c为WNN UMAP，按扰动和分化阶段着色，显示CRISPRi（EB）和CRISPRa（单层）的不同轨迹。d和e为GRN UMAP，展示不同分化阶段的调控子网络。f和g为GATA2敲低后的基因表达变化和通路富集。h和i为NR4A2过表达后的细胞命运偏移和神经元基因上调。

亮点 5｜阵列CRISPR筛选结合SUM-seq揭示细胞命运调控

在hiPS细胞自发分化过程中，利用CRISPRi/a靶向GATA2、NR4A2和SOX17，进行54重SUM-seq。共获得56,652个细胞核。GRN分析显示EB分化主要走向神经源性和神经嵴命运，而单层培养则依次激活多能性、滋养外胚层、中胚层和神经嵴程序。GATA2敲低减少侧板中胚层基因表达，增加骨骼和肌肉发育基因，同时GRHL1和TEAD1 motif活性升高，SOX9和SOX10活性降低。NR4A2过表达使细胞偏向神经外胚层命运，上调神经元基因，增加JUN和FOS motif活性，并重新激活OCT4和NANOG等多能性因子。这些结果展示了SUM-seq在解析扰动对细胞命运决定影响中的能力。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 组合索引、微流控、Tn5转座、逆转录、WNN、GRaNIE、chromVAR、MOFA、LDSC
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞多组学、基因调控网络或大规模扰动筛选的研究人员。

带走一句

SUM-seq以低成本实现百万级细胞和数百样本的多组学分析，为大规模扰动筛选和细胞图谱项目提供了可扩展的解决方案。