IF50.5｜TENT5A介导的再腺苷化增强mRNA疫苗效力

mRNA疫苗进入细胞后，其poly(A)尾可被TENT5A延长，从而增强稳定性和抗原产量。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

mRNA疫苗在COVID-19疫情中全球应用，但对其在体内的代谢过程知之甚少。治疗性mRNA的poly(A)尾长度对稳定性和翻译效率至关重要，通常认为其命运由脱腺苷化决定。然而，细胞内是否存在主动延长poly(A)尾的机制，以及该机制是否影响疫苗效力，此前未被探索。

科学问题

卡在哪里： 现有研究多聚焦于树突状细胞，而巨噬细胞作为主要摄取疫苗的细胞类型，其作用被忽视。此外，由于技术限制，治疗性mRNA在体内的poly(A)尾动态变化难以直接观测，导致对疫苗mRNA代谢的理解存在空白。

本文要回答： 本文旨在利用纳米孔直接RNA测序技术，解析mRNA疫苗在细胞和小鼠体内的poly(A)尾代谢过程，并鉴定参与调控的关键因子及其对疫苗效力的影响。

技术路线

作者主要用了：纳米孔直接RNA测序、sDTW算法、cDNA纳米孔测序、CRISPR–Cas9基因敲除、ELISA。

作者首先开发了增强型直接RNA测序（eDRS）流程，结合子序列动态时间规整（sDTW）算法，准确识别mRNA-1273疫苗的poly(A)尾及末端mΨCmΨAG五聚体。随后在细胞系和原代巨噬细胞中追踪疫苗mRNA的poly(A)尾动态，发现巨噬细胞中poly(A)尾被延长。通过转录组分析和基因敲除实验，确定TENT5A为关键酶。最后在小鼠模型中验证TENT5A对疫苗免疫原性的影响。

图 1　Fig. 1。图1展示eDRS原理及mRNA-1273在细胞系中的脱腺苷化。a部分示意纳米孔测序流程；b部分显示有无末端五聚体的信号差异；c部分显示HEK293T细胞中poly(A)尾随时间缩短，且缩短仅发生在无五聚体的转录本上。

核心亮点

亮点 1｜mRNA-1273在巨噬细胞中被再腺苷化

在mBMDMs和hMDMs中，mRNA-1273的poly(A)尾在24–48小时后被延长至约200个腺苷酸，且延长主要发生在去除末端mΨCmΨAG五聚体的转录本上。体内注射部位也观察到类似现象，表明再腺苷化是巨噬细胞对疫苗mRNA的主动调控。

图 2　Fig. 2。图2显示mRNA-1273在体内和巨噬细胞中的再腺苷化。a部分显示注射部位24小时poly(A)中位数从100增至114；b和c部分显示mBMDMs和hMDMs中poly(A)尾延长至200个腺苷酸；d部分显示BNT162b2再腺苷化较弱；e部分显示mRNA-1273体外翻译效率更高。

亮点 2｜TENT5A是负责再腺苷化的关键酶

通过转录组分析发现，mRNA-1273处理诱导Tent5a表达上调。在Tent5a/Tent5c双敲除或TENT5A快速降解的巨噬细胞中，mRNA-1273的poly(A)尾无法延长，且mRNA稳定性下降。siRNA敲低TENT5A同样抑制再腺苷化并减少抗原产生，证实TENT5A的必要性。

图 3　Fig. 3。图3展示mRNA-1273处理诱导TENT5A表达及内源转录本poly(A)变化。a部分显示124个内源转录本poly(A)尾延长，主要涉及免疫应答基因；b和c部分显示差异表达分析；d部分显示Tent5a特异性上调；e-g部分证实TENT5A蛋白水平升高。

亮点 3｜再腺苷化依赖于ER定位和FNDC3蛋白

TENT5A通过与ER跨膜蛋白FNDC3A和FNDC3B相互作用定位于ER。敲低Fndc3a和Fndc3b后，mRNA-1273的再腺苷化被消除。亚细胞分离实验显示，再腺苷化主要发生在膜组分，表明ER关联是TENT5A识别底物的前提。

图 4　Fig. 4。图4验证TENT5A在mRNA-1273再腺苷化中的作用。a部分显示Tent5a/Tent5c双敲除细胞中poly(A)尾缩短；b部分显示dTAG诱导的TENT5A快速降解抑制再腺苷化；c部分显示siRNA敲低TENT5A减少poly(A)长度和抗原产生；d部分显示双敲除细胞中mRNA稳定性下降；e部分显示其他poly(A)聚合酶敲低不影响再腺苷化。

亮点 4｜加帽方式影响再腺苷化效率

比较不同加帽方式的报告mRNA发现，酶法加帽（Cap1）的mRNA在巨噬细胞中发生高效再腺苷化，而共转录CleanCap加帽的mRNA则无此现象。这与蛋白表达水平差异一致，提示加帽结构影响mRNA与TENT5A的相互作用或翻译效率。

图 5　Fig. 5。图5探讨再腺苷化的底物特异性和影响因素。a部分显示Fndc3a/Fndc3b敲低消除再腺苷化；b部分显示共转染mRNA-1273和BNT162b2后，两者在膜组分中均被再腺苷化；c-e部分显示不同报告mRNA的再腺苷化情况，表明酶法加帽的ER靶向mRNA普遍被再腺苷化。

亮点 5｜TENT5A增强mRNA疫苗的免疫原性

在Tent5a敲除小鼠中，接种mRNA-1273或BNT162b2后血清抗刺突IgG水平显著低于野生型，而蛋白疫苗Nuvaxovid则无差异。条件性敲除CD11c+细胞中的Tent5a也降低抗原产生和抗体水平，表明巨噬细胞中的TENT5A对疫苗效力至关重要。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 纳米孔直接RNA测序、sDTW算法、cDNA纳米孔测序、CRISPR–Cas9基因敲除、ELISA
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事mRNA疫苗设计、RNA代谢或纳米孔测序分析的科研人员。

带走一句

分析mRNA疫苗或治疗性RNA的poly(A)尾动态时，应考虑细胞类型特异性的再腺苷化机制，尤其是巨噬细胞中的TENT5A。