IF46.9｜条形码sgRNA定向进化eVLPs提升递送效率

用条形码sgRNA标记每个eVLPs变体，定向进化出v5 eVLPs，递送效力提升2-4倍。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

工程化病毒样颗粒（eVLPs）作为瞬时递送蛋白质和RNA的载体，在基因编辑领域展现出潜力。与AAV等病毒载体相比，eVLPs避免了DNA整合风险和长期表达导致的脱靶编辑，同时保留了病毒的高效转导能力。此前开发的第四代（v4）eVLPs已在小鼠肝脏和视网膜中实现高效碱基编辑，但进一步提高其包装效率和转导效率仍面临挑战。定向进化是优化递送载体的有力手段，但传统方法依赖病毒基因组编码变体身份，而eVLPs不包装病毒基因组，因此需要新的策略来标记和筛选eVLPs变体。

科学问题

卡在哪里： eVLPs不包装病毒基因组，无法像传统病毒载体那样通过基因组测序来识别富集的变体，因此缺乏有效的定向进化策略。此外，野生型MMLV衣壳蛋白经过自然进化优化用于包装病毒基因组，而非用于包装大型非天然蛋白货物（如ABE），这限制了eVLPs的递送效率。

本文要回答： 开发一种基于条形码sgRNA的eVLPs定向进化系统，并利用该系统进化出具有更高生产效率和转导效率的eVLPs变体。

技术路线

作者主要用了：条形码sgRNA、eVLPs文库构建、生产筛选、转导筛选、Cryo-EM。

作者设计了一种条形码sgRNA标记策略：每个eVLPs变体与一个独特的条形码sgRNA在同一载体上表达，从而在eVLPs包装时将条形码sgRNA装入RNP货物中。通过低MOI慢病毒转导生成每个细胞只含一个条形码-变体对的eVLPs生产细胞文库。随后对文库进行生产筛选（比较eVLPs中条形码丰度与生产细胞gDNA中条形码丰度）和转导筛选（比较转导后细胞中条形码丰度与输入eVLPs中条形码丰度），富集的条形码指示具有优良性能的衣壳突变体。最后将有益突变组合，获得v5 eVLPs。

图 1　Fig. 1。图1展示了条形码eVLPs进化系统的原理和验证。a部分说明每个eVLPs变体与独特条形码sgRNA在同一载体上表达，包装后形成条形码eVLPs文库。b-c部分展示模拟生产筛选：Gag-ABE（条形码1）与无Gag的ABE（条形码2）混合生产，结果条形码1富集13倍。d-e部分展示模拟转导筛选：VSV-G（条形码1）与VSV-Gmut（条形码2）混合转导，条形码1富集2.4倍。这些结果证明条形码sgRNA能有效标记并区分不同功能的eVLPs。

核心亮点

亮点 1｜条形码sgRNA有效标记eVLPs

作者验证了在sgRNA四环中插入15bp条形码不影响eVLPs的碱基编辑效率。通过两个模拟筛选实验证明了系统的可行性：在生产筛选中，Gag-ABE融合蛋白的eVLPs（条形码1）相比无Gag融合的ABE（条形码2）富集13倍；在转导筛选中，VSV-G包膜的eVLPs（条形码1）相比VSV-Gmut包膜的eVLPs（条形码2）富集2.4倍。这些结果表明条形码sgRNA能够准确反映eVLPs变体的功能差异，为后续衣壳进化奠定了基础。

图 2　Fig. 2。图2展示了条形码eVLPs衣壳文库的构建和筛选结果。a部分说明通过慢病毒转导生成每个细胞含单一整合的条形码衣壳突变体生产细胞文库。b部分概述了生产和转导筛选流程。c部分以散点图展示每个突变体在两个筛选中的富集值，大多数突变体表现差于野生型，少数在生产或转导中富集，但几乎没有同时改善两者。蓝色点标记了36个候选突变体用于后续验证。

亮点 2｜衣壳突变体筛选揭示功能权衡

构建了包含3,762个MMLV Gag衣壳和核衣壳单残基突变体的条形码eVLPs文库，并分别进行生产和转导筛选。结果显示，约8%的突变体在生产筛选中富集超过野生型，而仅0.7%的突变体在转导筛选中富集超过野生型。整合两个筛选结果发现，大多数突变体同时损害生产和转导，少数突变体改善其中一项但损害另一项，几乎没有突变体同时改善两者。例如，R440P或R443P改善转导但损害生产，而L478K、A479K或T480H改善生产但损害转导。这表明eVLPs的生产和转导效率由不同且可能相互竞争的机制决定。

图 3　Fig. 3。图3展示了衣壳突变体组合对eVLPs效力的影响。a部分显示在GagQ226P-Pro-Pol背景下，多个Gag-ABE突变体使碱基编辑效率提高2-3倍。b部分系统评估了五种C端突变体与Q226P在不同组合中的表现，发现GagC507V-ABE + GagQ226P-Pro-Pol组合效果最佳。c部分显示该组合（v5）在HEK293T细胞中EC50比v4提高3.7倍。d-i部分显示v5在N2A细胞多个位点均优于v4。

亮点 3｜组合突变产生v5 eVLPs

将生产筛选中富集最强的Q226P突变引入Gag-Pro-Pol后，再测试36个候选衣壳突变体在Gag-ABE中的效果，发现多个突变体使碱基编辑效率提高2-3倍。进一步系统评估五种C端突变体（R501I、D502Q、A505W、C507F、C507V）与Q226P的组合，发现GagC507V-ABE + GagQ226P-Pro-Pol组合的EC50比v4 eVLPs提高3.7倍，被命名为v5 BE-eVLPs。在HEK293T和N2A细胞中，v5 BE-eVLPs均表现出2-4倍的效力提升。此外，v5 Cas9-eVLPs也显示出2倍效力提升，但v5 PE-eVLPs未观察到改善。

图 4　Fig. 4。图4比较了v4和v5 BE-eVLPs在原代人HSPCs中的碱基编辑效率。a-c部分显示在BCL11A增强子A4、A7及双位点编辑中，v5均显著优于v4，EC50降低2.6倍。d部分显示v4和v5 eVLPs处理后的HSPCs活力与未处理对照无显著差异。这些结果表明v5 eVLPs在治疗相关原代细胞中具有更高递送效力且不影响细胞活力。

亮点 4｜v5 eVLPs在原代HSPCs中效力提升

在健康人原代造血干细胞（HSPCs）中比较v4和v5 BE-eVLPs的碱基编辑效率，靶向BCL11A增强子。结果显示，v5 BE-eVLPs的EC50比v4低2.6倍（P<0.0001），且v4最高剂量达到的编辑效率，v5只需1/16剂量即可达到。此外，v4和v5 eVLPs处理后的HSPCs活力与未处理对照相当，表明eVLPs对细胞活力无显著影响。这些结果提示v5 eVLPs在治疗性基因编辑中具有潜力。

图 5　Fig. 5。图5揭示了v5 eVLPs的机制特征。a-b部分标注了Q226P和C507V突变的位置。c部分显示v5中ABE货物切割比例高于v4。d-e部分显示v5中ABE蛋白和sgRNA包装量分别增加1.8倍和4.3倍。f-h部分冷冻电镜图像和分类显示v5中无成熟衣壳，而v4中52%为成熟衣壳。i部分显示v5平均直径略大于v4且尺寸分布右移。这些结果说明v5突变优化了RNP包装并改变了衣壳结构。

亮点 5｜v5 eVLPs改善RNP包装与释放

机制研究表明，v5 eVLPs中ABE蛋白包装量增加1.8倍，sgRNA包装量增加4.3倍，且衣壳-货物连接子的切割效率更高。Q226P突变位于衣壳域N端，可能影响蛋白酶切割位点的加工；C507V突变破坏了核衣壳域CCHC锌指基序，该基序在野生型病毒中负责包装基因组，但在eVLPs中不再必需。这些结果说明v5突变优化了RNP货物的包装和释放，而非病毒基因组。

亮点 6｜v5 eVLPs衣壳结构改变

冷冻电镜分析显示，v4 eVLPs中52%为包膜成熟衣壳，18%为包膜未成熟衣壳，30%为无包膜成熟衣壳；而v5 eVLPs中未观察到成熟衣壳，68%为包膜未成熟衣壳，8.7%为包膜未定义衣壳，23%为无包膜未成熟衣壳。此外，v5 eVLPs平均直径（137 nm）略大于v4（131 nm），且尺寸分布显著偏向更大颗粒（P<0.0001）。这些结果表明v5突变抑制了衣壳成熟，但未成熟衣壳足以支持甚至更利于eVLPs递送RNP货物。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 条形码sgRNA、eVLPs文库构建、生产筛选、转导筛选、Cryo-EM
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事基因编辑递送、病毒载体工程或定向进化研究的科研人员。

带走一句

条形码sgRNA标记策略为无基因组递送载体提供了通用进化框架，可推广至其他eVLPs组件或非病毒递送系统。