IF36.1｜Perturb-tracing：高通量筛选多尺度三维基因组调控因子

一种结合CRISPR筛选与染色质示踪的新方法，一次性发现21个多尺度三维基因组调控因子。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

三维基因组组织在发育、衰老和疾病中发生动态变化，并与基因表达、DNA复制时序和突变易感性等基因组功能密切相关。染色质折叠在多个尺度上受到调控，包括拓扑关联结构域（TAD）、A/B区室和染色体疆域。已知的调控因子如CTCF和cohesin复合物在染色质环挤出和区室化中发挥关键作用，但我们对不同尺度染色质结构的调控网络仍缺乏系统认识。此前的研究主要依赖单基因扰动或低通量成像筛选，难以同时评估多个尺度的染色质结构变化。高通量测序方法如Perturb-seq和单细胞ATAC-seq虽然能发现局部染色质可及性的调控因子，但无法直接观测高阶染色质折叠构象。因此，开发一种能够并行筛选多尺度染色质组织调控因子的技术，对于理解三维基因组的调控机制至关重要。

科学问题

卡在哪里： 现有技术无法高效筛选多尺度染色质折叠的调控因子。基于测序的方法只能提供局部染色质可及性信息，而基于成像的筛选通常局限于单一表型（如一对位点的距离）。此外，缺乏在单细胞中同时读取遗传扰动和三维基因组表型的高通量方法，限制了系统性发现新调控因子的能力。

本文要回答： 开发一种结合CRISPR筛选、细胞条形码读出和染色质示踪的高通量成像平台，用于系统性发现调控TAD、区室和染色体疆域等不同尺度染色质折叠的新因子。

技术路线

作者主要用了：CRISPR-Cas9、BARC-FISH、染色质示踪、高通量成像、相关性分析。

作者开发了Perturb-tracing平台，将混合CRISPR筛选与高内涵成像相结合。首先构建了包含420个sgRNA（靶向137个候选基因）的慢病毒文库，每个sgRNA与一个十位三进制RNA条形码配对。通过BARC-FISH技术，利用滚环扩增和顺序荧光原位杂交，在单细胞中原位解码条形码，从而识别每个细胞的遗传扰动。同时，对chr22上27个TAD进行多重DNA FISH染色质示踪，获取单细胞中染色质折叠构象。最后，通过计算分析比较不同扰动下多尺度染色质结构特征的变化，筛选出新的调控因子。

图 1　Fig. 1。图1展示了Perturb-tracing筛选的整体流程。a部分显示对chr22上27个TAD进行多重DNA FISH染色质示踪，同时通过BARC-FISH解码条形码。b部分展示了BARC-FISH方法：表达的条形码RNA由十个三进制数字组成，每个数字有三种可能的值（0、1、2），分别用橙色、青色和品红色表示。c部分是一个解码示例，展示了从17个重复数据集中一个视野的荧光图像。该图说明了如何将遗传扰动与三维基因组表型在单细胞中关联起来。

核心亮点

亮点 1｜染色质压缩与核形状的功能关联

通过分析DAPI染色模式，作者发现RB1和MYBPH敲除降低核内染色质强度不均匀性，而TRIM36和EEPD1敲除降低核球形度并导致多叶核。相关性分析显示，染色质压缩特征（如接触频率增加）与核球形度正相关。CHD7敲低和PCBP1敲除均导致核球形度降低，而ZNF114敲除略微增加核球形度。模拟实验表明，降低染色质单体间相互作用强度会导致染色质折叠更不规则，进而使核膜呈现多叶形状。这些结果支持染色质压缩介导核形态的模型。

图 2　Fig. 2。图2展示了筛选结果中不同扰动对染色质折叠的影响。a部分是相邻TAD距离的log2倍数变化与FDR的火山图，标记了显著上调（蓝色）和下调（红色）的核蛋白命中。b部分显示选定命中在chr22上相邻TAD距离的变化。c部分比较了对照和选定命中细胞中相邻TAD的空间距离。d-i部分分别展示了长程A-A、A-B和B-B接触频率的变化。j-l部分显示整体染色体疆域压缩的变化。m部分总结了顶级命中在多个尺度上的效应，表明大多数调控因子影响多个染色质结构特征。

补充图

图 3　Fig. 3。图3展示了新调控因子与已知三维基因组机制的相关性分析。a-c部分显示DDX24、MRVI1和ZNF114与NIPBL在短程染色质距离上的相关性，提示它们可能参与环挤出。d-e部分展示了chr22的A-B区室评分谱和TAD对之间的平均区室评分矩阵。f-i部分显示顶级命中与A-B区室评分矩阵的相关性，其中FAM69B、ZNF114等正相关，PDE1A等负相关。j-l部分展示了顶级命中之间的相关性聚类，揭示了潜在的共调控机制。

图 4　Fig. 4。图4验证了CHD7对染色质压缩的调控作用。a部分显示siRNA敲低CHD7后蛋白水平降低超过90%。b-c部分显示siCtrl和siCHD7细胞的A-B区室谱基本一致。d部分显示两种情况下A-B区室均保持极化排列。e部分显示siCHD7细胞中A-A、B-B和A-B接触频率均降低。f-i部分显示CHD7敲低导致整体染色体去压缩，且长程效应更显著。j-m部分验证了PCBP1敲除导致多尺度染色质去压缩，n-o部分验证了ZNF114敲除导致染色质压缩。

图 5　Fig. 5。图5展示了核形态调控因子的发现及其与染色质压缩的关联。a-b部分显示RB1和MYBPH敲除降低核内染色质强度不均匀性。c-d部分展示了对照和RB1敲除细胞的核强度分布。e-g部分显示TRIM36和EEPD1敲除降低核球形度并导致多叶核。h部分显示染色质折叠特征与核球形度之间的相关性。i-k部分验证了CHD7、PCBP1和ZNF114扰动对核形状的影响。l部分通过模拟表明染色质压缩介导核形态。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CRISPR-Cas9、BARC-FISH、染色质示踪、高通量成像、相关性分析
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事三维基因组、CRISPR筛选、单细胞成像或多组学整合的研究人员。

带走一句

Perturb-tracing将混合CRISPR筛选与高内涵成像结合，为系统性发现多尺度三维基因组调控因子提供了新范式，可扩展至其他细胞类型和扰动方式。