IF50.5｜胰腺癌重编程神经元的单细胞解析

Trace-n-Seq揭示胰腺癌如何劫持神经，去神经增敏免疫治疗。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

外周神经系统在器官功能与疾病中发挥关键作用。包括胰腺导管腺癌（PDAC）在内的大多数癌症都被外周神经元浸润，这构成了复杂的肿瘤微环境（TME）。然而，神经元的胞体位于远离肿瘤的神经节中，因此现有的组织测序数据集中缺乏支配癌症或健康器官的神经元信息。此前研究已发现背根神经节（DRG）感觉神经元和腹腔神经节（CG）交感神经元促进PDAC生长，而胆碱能迷走神经活动则减缓其生长。PDAC的标志包括促结缔组织增生性间质生态系统，表现出神经肥大和神经周围浸润。神经肥大与肿瘤进展、转移和疼痛相关，但机制不明。

科学问题

卡在哪里： 由于神经元胞体位于肿瘤外，现有bulk或单细胞RNA测序数据集均缺失支配肿瘤的神经元分子信息，导致无法在单细胞水平解析癌症对神经元的分子重编程及其与TME的相互作用。

本文要回答： 开发Trace-n-Seq技术，在单细胞分辨率下表征支配健康胰腺和PDAC的神经元，揭示癌症驱动的神经元重编程，并探索去神经治疗策略。

技术路线

作者主要用了：逆向示踪、FACS、Smart-seq2、Barcode-seq、10X Genomics、LSFM、iDISCO。

作者开发了Trace-n-Seq：将荧光逆行示踪剂Fast Blue（FB）术中注射到目标器官，FB被支配该器官的神经元末梢摄取并逆行运输至神经节胞体；5-14天后取出神经节，消化并用FACS分选FB+神经元，进行单细胞RNA测序（Smart-seq2或Barcode-seq）。首先在健康胰腺中建立神经元图谱，然后应用于多种PDAC模型（PDX、EPO、KPC）及黑色素瘤和胰腺炎模型，比较神经元转录组变化，并结合TME单细胞数据构建相互作用网络。

图 1　Fig. 1。图1展示Trace-n-Seq工作流程：FB注射到胰腺，逆行标记DRG和CG神经元，FACS分选FB+细胞进行单细胞测序。通过LSFM和免疫荧光定量，显示75-90%的CG神经元和4-15%的DRG神经元投射到胰腺。t-SNE投影将胰腺支配神经元映射到PNS图谱，鉴定出CG1、CG2、NEFM、PEP、NPEP等亚型，并验证了SLIT2和CGRP的表达。

核心亮点

亮点 1｜Trace-n-Seq实现器官神经支配单细胞图谱

作者开发Trace-n-Seq，通过FB逆行标记和FACS分选，对健康小鼠胰腺、脾脏、结肠和腹膜等器官的支配神经元进行单细胞测序。在胰腺中鉴定出两个交感CG亚型（CG1、CG2）和三个感觉DRG亚型（NEFM、PEP、NPEP）。与腹膜相比，胰腺有更多NEFM神经元，腹膜有更多CGRP+伤害感受器。CG神经元中未检测到支配汗腺的胆碱能神经元。该技术可推广至任何组织，为器官神经支配提供分子见解。

图 2　Fig. 2。图2比较健康胰腺和PDAC的神经支配。LSFM显示PDAC中神经元广泛出芽，神经面积/组织面积比显著增加。t-SNE整合健康与PDAC神经元，火山图显示CG和DRG中大量DEGs。PCN签名在PDAC神经元中富集，且在JNG中也得到验证。此外，靠近肿瘤的脾脏和腹膜神经元也呈现PCN-up富集，而远处无变化，表明肿瘤影响具有区域局限性。

亮点 2｜PDAC诱导神经元转录重编程与PCN签名

比较354个健康与960个PDAC CG神经元，发现431个差异表达基因（DEGs），涉及轴突导向、代谢、基质和免疫调节。PDAC神经元下调神经肽（Gal）、受体（Erbb2/3、Ntrk3）和代谢基因，上调Robo1、Hoxc5、Fgf14等。DRG神经元中NEFM亚型变化最显著（155个DEGs），而PEP和NPEP仅少数变化。整合五个主要亚型反复出现的DEGs，生成PCN-up（45基因）和PCN-down（46基因）签名，在多个独立模型中验证，可区分健康与PDAC神经元，且与炎症或损伤签名不同。

图 3　Fig. 3。图3研究胰腺内黑色素瘤模型，发现其神经支配频率低于PDAC。t-SNE整合不同模型神经元，PCN签名在黑色素瘤DRG中富集。热图显示癌症模型（KPC、黑色素瘤）与胰腺炎相比，DRG亚型频率变化不同：癌症中NEFM增加，PEP/NPEP减少，而胰腺炎无此变化。3D成像和免疫荧光证实PDAC中CGRP+神经元减少，SLIT2+增加。配体-受体分析显示CAF与神经元相互作用最强，且PDAC中显著增强。

亮点 3｜癌症特异性吸引NEFM感觉神经元

在PDAC、KPC和黑色素瘤模型中，支配肿瘤的DRG神经元亚型频率发生改变：NEFM神经元比例增加，而PEP和NPEP减少。这种亚型转换在胰腺炎中不存在。3D成像显示PDAC中CGRP+神经元面积减少，而SLIT2+神经元增多。人类PDAC样本中CGRP阳性神经面积也减少。这表明多种胰腺内癌症而非炎症优先吸引NEFM型感觉神经元。

图 4　Fig. 4。图4展示交感去神经对PDAC生长和TME的影响。6-OHDA或神经节切除术在PDX和KPC模型中均显著减小肿瘤重量。去神经后肿瘤内神经纤维减少，scRNA-seq显示CAF增殖和氧化磷酸化基因下调，炎症基因上调，CD45+细胞浸润增加。在KPC模型中，6-OHDA与nivolumab联用使肿瘤缩小5.7倍，而单独使用nivolumab无效。

亮点 4｜神经元-肿瘤-微环境互作组揭示CAF为关键靶点

整合神经元与TME单细胞数据，构建配体-受体相互作用网络。成纤维细胞（尤其是CAF）是神经元最强的相互作用伙伴，PDAC细胞与神经元的相互作用评分高于健康上皮细胞。显著增强的相互作用包括Efna5-Epha5、Gas6-Tyro3、Il6-Il6st等。体外共培养实验证实神经元或神经元条件培养基促进PDAC细胞、成纤维细胞和CAF增殖（30-50%），CG神经元作用最强。

图 5　Fig. 5。图5研究神经元在局部复发和治疗中的作用。切除原发肿瘤后，曾荷瘤小鼠的继发肿瘤增大2.5倍，但6-OHDA去神经可阻止此效应。切除后4周，CG神经元仍保持PCN签名。Nab-paclitaxel治疗减少肿瘤内神经纤维和支配神经元比例，而奥沙利铂无此效果。患者样本中，nab-paclitaxel治疗者神经/肿瘤比率降低。6-OHDA与nab-paclitaxel联用产生协同抗肿瘤效应，肿瘤缩小达16.5倍。

亮点 5｜交感去神经增敏免疫治疗并抑制复发

通过手术切除CG或6-OHDA化学去神经，PDAC肿瘤重量减少最多三倍。去神经后TME中CAF减少，并上调干扰素α反应和炎症基因，CD45+免疫细胞浸润增加。在KPC模型中，单独使用免疫检查点抑制剂nivolumab无效，但与6-OHDA联用使肿瘤缩小5.7倍。在切除后复发模型中，曾荷瘤小鼠的继发肿瘤增大2.5倍，但6-OHDA去神经可阻止这种加速生长。切除后4周，CG神经元仍保持PCN签名，表明交感神经元维持“癌症神经状态”。

亮点 6｜白蛋白紫杉醇通过去神经发挥抗肿瘤作用

标准化疗药物nab-paclitaxel在PDX模型中显著减少肿瘤内神经纤维（62%），并降低支配肿瘤的CG和DRG神经元比例（CG从84%降至27%，DRG降低9.8倍），但神经元胞体数量不变。相比之下，奥沙利铂（FOLFIRINOX成分）虽缩小肿瘤但不影响神经元浸润。患者样本中，接受吉西他滨+nab-paclitaxel治疗者神经/肿瘤比率降低，而FOLFIRINOX治疗者无此变化。将6-OHDA与nab-paclitaxel联用产生协同效应，肿瘤缩小达16.5倍，提示靶向剩余神经元可增强化疗效果。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 逆向示踪、FACS、Smart-seq2、Barcode-seq、10X Genomics、LSFM、iDISCO
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事肿瘤微环境、神经-癌症互作、单细胞组学方法开发的研究者。

带走一句

Trace-n-Seq为研究器官神经支配提供了通用工具，揭示癌症对神经元的特异性重编程，提示去神经联合免疫或化疗是潜在治疗策略。