IF46.9｜热稳定Cas9 RNP脂质纳米颗粒实现肝肺高效编辑

进化改造的iGeoCas9结合LNP递送，单次静脉注射即可在肝肺实现16–37%编辑效率。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

CRISPR-Cas9基因编辑为遗传病治疗带来希望，但体内递送仍是瓶颈。病毒载体存在免疫原性、整合风险及持续表达导致的脱靶问题；LNP-mRNA虽在肝脏编辑成功，但向非肝组织递送困难，且面临sgRNA不稳定、TLR激活和翻译效率低等挑战。直接递送RNP可规避mRNA的翻译步骤、降低免疫原性并减少脱靶，但RNP负电荷密度不足、LNP制备中的有机溶剂易使蛋白变性，导致递送效率低下。来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的GeoCas9具有高热稳定性和高负电荷密度，适合LNP递送，但其编辑效率低且PAM限制大。

科学问题

卡在哪里： 现有LNP递送RNP的策略主要局限于肝脏，对肺等非肝器官编辑效率极低；同时，野生型GeoCas9在哺乳细胞中编辑活性差，PAM序列严格（5′-N4CRAA-3′），限制了其应用。

本文要回答： 通过定向进化改造GeoCas9获得高效、PAM宽松的iGeoCas9，并开发合适的LNP配方，实现RNP在体外和体内（尤其肝、肺）的高效递送与基因编辑。

技术路线

作者主要用了：细菌双质粒选择系统、定向进化、LNP组装、流式细胞术、NGS、Ai9报告小鼠。

作者首先利用细菌双质粒选择系统对GeoCas9进行定向进化，通过随机诱变和筛选获得编辑效率提高且PAM拓宽的iGeoCas9突变体。随后，他们优化LNP配方，筛选出能高效包载iGeoCas9 RNP的脂质组合，并验证其在多种细胞系中的编辑效率。进一步，通过共递送ssDNA模板实现HDR。最后，开发组织选择性LNP配方（FX12m靶向肝、FC8m靶向肺），在Ai9报告小鼠和野生型小鼠中评估体内编辑效果。

图 1　Fig. 1。图1展示了GeoCas9定向进化的流程和结果。a为细菌双质粒选择系统示意图，利用ccdB毒素基因筛选高活性突变体。b显示进化谱系，R1W1突变体包含8个有益替换。c比较了野生型GeoCas9、R1W1和SpyCas9的熔解温度，R1W1保持55°C高热稳定性。d为Ai9 NPCs编辑实验设计，靶向SV40 poly(A)终止盒以激活tdTomato。e显示R1W1编辑效率较野生型提高>100倍。f展示iGeoCas9(G)的PAM偏好改变。

核心亮点

亮点 1｜定向进化获得高效iGeoCas9

通过细菌选择系统对GeoCas9进行多轮随机诱变和筛选，获得突变体R1W1（iGeoCas9(C2)），其在NPCs中的编辑效率较野生型提高>100倍，且PAM从5′-N4CRAA-3′拓宽至5′-N4CNNA-3′。iGeoCas9(C2)的熔解温度为55°C，远高于SpyCas9的43°C，保留了高热稳定性。此外，引入T1015A和D1017N突变产生iGeoCas9(G)，将PAM首碱基偏好从C变为G，进一步扩展靶向范围。

图 2　Fig. 2。图2比较了iGeoCas9、SpyCas9和iCas12a在核转染和LNP递送下的编辑效率。核转染时三者效率相近，但LNP递送时iGeoCas9效率高出SpyCas9两倍以上，iCas12a无编辑。b展示所用脂质化学结构及两种LNP配方（standard和cationic）的粒径和PDI。iGeoCas9 sgRNA更长（139 nt vs 96 nt），增加负电荷密度，利于LNP包载。

亮点 2｜LNP递送iGeoCas9 RNP编辑多种细胞

优化LNP配方后，iGeoCas9 RNP-LNP在NPCs中的编辑效率与核转染相当，且优于SpyCas9和iCas12a的LNP递送。化学修饰sgRNA（2′-O-甲基化和硫代磷酸酯键）可进一步提高编辑效率。在HEK293T细胞中，LNP递送iGeoCas9 RNP敲除EGFP的效率高达99%。LNP-RNP复合物在4°C储存1个月后仍保持高活性。

图 3　Fig. 3。图3展示LNP递送iGeoCas9 RNP在NPCs和HEK293T细胞中的编辑效果。a显示LNP递送与核转染效率相当。b表明sgRNA化学修饰（ms）提高编辑效率。c为HEK293T EGFP细胞中LNP递送敲除EGFP的效率，与核转染相当。d显示LNP-RNP在4°C储存1个月后仍保持高编辑活性。

亮点 3｜共递送ssDNA实现高效HDR

LNP可同时包载iGeoCas9 RNP和ssDNA模板，ssDNA的存在使LNP粒径从~180 nm减小至140–150 nm，并提高编辑效率。在HEK293T细胞中，共递送实现20–40%的HDR（EGFP到BFP转换），总编辑效率达50–75%。在内源位点EMX1和AAVS1，HDR效率最高达66%，总编辑效率达95%。在CFTR突变细胞系中，HDR纠正致病突变效率为7%。

图 4　Fig. 4。图4展示LNP共递送iGeoCas9 RNP和ssDNA模板实现HDR。a为共包载LNP的表征，ssDNA使粒径减小。b为EGFP到BFP转换实验，HDR效率20–40%，总编辑50–75%。c为内源位点EMX1和AAVS1的HDR效率，最高达66%。

亮点 4｜筛选新型离子化脂质提升递送效率

为去除免疫原性较强的DOTAP，作者筛选了13种离子化脂质，发现LP01和BP lipid 312在FX配方中效果最佳，lipid III-45在FC配方中效果最佳。由此建立FX12和FC8配方，其RNP包封率分别达80%和98%，粒径176 nm和112 nm。FX12在低剂量下编辑效率比标准配方高1–2个数量级。RNP递送比mRNA+sgRNA递送效率更高，且不受sgRNA化学修饰影响。

图 5　Fig. 5。图5展示离子化脂质筛选和新型LNP配方优化。a为FX和FC配方设计。b为筛选结果，LP01、BP lipid 312和lipid III-45效果最佳。c为FX12和FC8 LNP的表征，包封率80%和98%，粒径176 nm和112 nm。d显示FX12在低剂量下编辑效率远高于标准配方。e比较mRNA+sgRNA与RNP递送，RNP效率更高且不受sgRNA修饰影响。

亮点 5｜体内实现肝肺高效编辑

单次静脉注射FX12m LNP（4.6 mg/kg RNP）在Ai9小鼠肝脏实现平均37%编辑，其中肝细胞34%、巨噬细胞54%、内皮细胞75%；FC8m LNP（2.3 mg/kg RNP）在肺实现平均16%编辑，其中内皮细胞41%、上皮细胞18%、免疫细胞6%。在野生型小鼠中，FX12m编辑PCSK9基因效率达31%，FC8m编辑SFTPC基因效率达19%。未观察到明显免疫反应或肝毒性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 细菌双质粒选择系统、定向进化、LNP组装、流式细胞术、NGS、Ai9报告小鼠
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事基因编辑递送、LNP开发或体内基因治疗研究的科研人员。

带走一句

热稳定Cas9突变体结合优化LNP配方，可绕过mRNA翻译瓶颈，实现RNP高效体内递送，为基因编辑治疗提供新思路。