IF50.5｜小鼠视觉皮层跨区功能连接组学数据集

首个将毫米级EM连接组与约7.5万神经元钙成像功能数据对齐的开放资源。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

理解大脑需要同时了解神经元的功能反应和塑造这些反应的环路结构。传统方法如单细胞记录或病毒示踪只能提供碎片化信息。近年来，体积电子显微镜（EM）与钙成像的结合在较小尺度上展示了潜力，但尚未在立方毫米尺度实现。小鼠视觉皮层是研究感觉处理的理想模型，其初级视区（VISp）和高级视区（VISrl、VISal、VISlm）之间的前馈和反馈连接对于理解视觉信息整合至关重要。此前研究受限于成像体积、神经元数量和连接组完整性，难以系统地将单个神经元的视觉反应特性与其突触连接模式联系起来。

科学问题

卡在哪里： 此前功能连接组研究要么功能记录神经元数量少（几十到几百个），要么EM重建体积小或连接组不完整，无法在皮层柱和跨脑区水平同时获得大规模功能数据和密集连接组。此外，缺乏将功能数据与EM数据精确配准的标准化流程，限制了将神经元反应特性与突触连接直接关联的能力。

本文要回答： 本文旨在构建一个包含约7.5万个功能表征神经元和超过2亿突触的毫米级功能连接组数据集，并验证其用于揭示视觉皮层环路结构-功能关系的可行性。

技术路线

作者主要用了：双光子钙成像、串行切片透射电镜、卷积网络分割、ChunkedGraph校对、功能-结构配准。

作者首先对清醒小鼠进行双光子钙成像，记录视觉刺激下约7.5万个兴奋性神经元的反应，同时采集结构图像用于后续配准。然后对同一脑组织进行连续切片和透射电镜成像，获得约1.3×0.87×0.82 mm³体积的纳米级分辨率图像。利用卷积神经网络进行自动分割，并通过ChunkedGraph系统进行大规模校对，重建神经元及其突触连接。最后通过基于血管和胞体的多阶段配准，将钙成像数据与EM重建对齐，实现功能与结构的整合。

图 1　Fig. 1。图1展示了MICrONS数据集的九类公开数据资源及其关系。核心是体内双光子钙成像数据（包括功能图像、结构图像、视觉刺激和行为测量），以及衍生数据（约75,909个锥体细胞的反应、瞳孔位置和运动速度）。这些数据与EM重建、突触连接、细胞分割和注释等共同构成完整的功能连接组资源。

核心亮点

亮点 1｜跨脑区功能连接组数据资源

数据集包含约75,909个兴奋性神经元的功能记录，跨越VISp、VISrl、VISal和VISlm四个视觉区，以及超过200,000个细胞和5.24亿突触的EM重建。功能数据来自14次扫描，包含自然电影和参数化刺激下的反应。EM数据分为两个子体积，共27,972个40nm切片。自动分割和校对产生了高精度的神经元重建，其中1,433个神经元具有校对过的轴突，最长兴奋性轴突达18.9mm，包含2,483个输出突触。该数据集通过MICrONS Explorer网站公开，并提供多种工具进行交互式探索和程序化分析。

图 2　Fig. 2。图2概述了生成MICrONS数据集的主要步骤。首先在体记录神经元功能特性并采集结构图像，然后固定脑组织、切片并进行透射电镜成像，组装成3D体积。随后自动重建神经元和突触，最后进行校对和注释。该流程展示了从功能成像到连接组重建的完整管线。

亮点 2｜功能-结构配准精度达微米级

通过三阶段配准流程，将功能ROI与EM神经元匹配。首先使用2,934个专家标注的基准点（1,994个胞体和942个血管分支点）计算变换，平均残差3.8μm。然后专家手动匹配了19,181个功能ROI到15,439个EM神经元。最后开发了两种自动匹配方法：基于基准点的自动匹配（精度83%，过滤后90%）和仅基于血管分割的自动匹配（精度84%，过滤后90%）。两种方法一致的匹配达到89%精度，共60,091个功能ROI匹配到29,620个EM神经元。这一精度使得在单个神经元水平将视觉反应特性与突触连接关联成为可能。

图 3　Fig. 3。图3展示了双光子功能成像的细节。a显示功能成像体积与血管标记，b显示104个平面在结构堆栈中的配准，c显示前后配准场相对于软膜表面的平均深度，d显示功能掩模在结构堆栈中的3D分布，不同颜色代表不同视觉区。e展示了五种刺激类型（电影、Sports-1M、渲染、Monet2和Trippy）的示例帧，f显示了对重复刺激的可靠性（oracle score）。

亮点 3｜大规模校对提升连接组完整性

自动分割后，通过人工和自动校对纠正了大量错误。共执行了1,046,656次编辑，包括合并缺失片段和拆分错误合并。校对后，84,035个神经元被分割为单个胞体对象。对于校对过树突的神经元，99%的输入突触正确关联到突触后胞体。校对过的兴奋性神经元轴突平均包含数百到数千个输出突触，其中60-95%可以映射到已知胞体位置的目标神经元。一个L2/3锥体神经元的例子显示，其1,412个突触中74.5%连接到有核对象，其中662个为兴奋性目标，275个为抑制性目标。

图 4　Fig. 4。图4展示了EM数据与体内结构数据的配准。a显示EM数据集（灰色）与2P结构数据（血管红色，GCaMP绿色）的配准，黑色线为钙成像确定的区域边界。b和c展示了精细对齐的质量及其对大褶皱的鲁棒性。该配准使得功能数据能够映射到EM重建上。

亮点 4｜揭示细胞类型特异的连接模式

利用校对后的神经元，分析了兴奋性和抑制性神经元之间的层间通讯差异。数据包含超过900,000个神经元间突触连接，使得能够全面分析细胞类型连接，包括跨突触的多步追踪。例如，追踪L3锥体神经元到其直接靶标（一阶连接）以及这些靶标抑制性神经元的二阶连接，揭示了特定细胞类型的连接特异性。伴随研究进一步表明，连接性可用于识别仅凭形态难以区分的细胞类型，并建立了连接组与转录组定义的细胞类型之间的对应关系。

图 5　Fig. 5。图5展示了校对后的神经元重建。a显示从EM图像重建的锥体细胞，b显示跨越子体积边界的锥体细胞，c显示子体积65中78个校对过的锥体细胞，d显示一对由突触连接的远距离锥体细胞。这些重建展示了数据集的规模和连接组完整性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 双光子钙成像、串行切片透射电镜、卷积网络分割、ChunkedGraph校对、功能-结构配准
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事连接组学、视觉神经科学或计算神经科学的研究者，尤其是需要整合功能与结构数据的团队。

带走一句

大规模功能连接组数据集为在单细胞水平关联神经反应与突触连接提供了模板，其开放工具和配准流程可复用于其他脑区或物种。