IF36.1｜Chip-Tip工作流实现单细胞蛋白质组深度与通量双突破

单细胞蛋白质组学新方法Chip-Tip在HeLa细胞中鉴定超过5000种蛋白质，并实现每日120个样本的高通量。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

单细胞RNA测序已广泛用于解析细胞异质性，但mRNA水平不能完全反映蛋白质的功能状态。单细胞蛋白质组学（SCP）可直接测量单个细胞的蛋白质组及其翻译后修饰，对于理解细胞分化、疾病机制和发现细胞类型特异性标志物至关重要。然而，SCP仍面临灵敏度、通量和重现性等挑战。现有方法通常每个细胞鉴定1000-2000个蛋白质，深度有限。样本制备过程中的肽段损失、化学修饰和离子操控等问题制约了鉴定深度。此外，翻译后修饰（如磷酸化和糖基化）的检测通常需要特异性富集，增加了实验复杂性。因此，亟需一种高灵敏度、高通量且能直接检测翻译后修饰的单细胞蛋白质组学工作流程。

科学问题

卡在哪里： 现有单细胞蛋白质组学方法每个细胞仅能鉴定约1000-2000个蛋白质，深度不足以覆盖低丰度转录因子和细胞类型特异性标志物。翻译后修饰的检测依赖富集步骤，难以在单细胞水平直接进行。此外，样本制备中的肽段损失和低通量限制了大规模应用。

本文要回答： 开发一种高灵敏度、高通量的单细胞蛋白质组学工作流程，实现深度蛋白质组覆盖，并直接检测翻译后修饰，无需富集。

技术路线

作者主要用了：cellenONE单细胞分选、proteoCHIP EVO 96芯片、Evosep One LC、nDIA、Orbitrap Astral质谱。

作者开发了Chip-Tip工作流程，将单细胞分选和样本制备集成在cellenONE平台上的proteoCHIP EVO 96芯片中，以纳升级体积进行一锅法裂解和消化。随后，通过离心将肽段直接转移到Evotip上，无需额外移液步骤，减少损失。样品经Evosep One液相色谱系统以Whisper梯度分离，并采用窄窗口数据非依赖采集（nDIA）在Orbitrap Astral质谱上分析。通过系统评估不同nDIA方法（如4Th6ms、8Th12ms等），优化了离子注入时间和隔离窗口，以最大化蛋白质鉴定深度。此外，还评估了不同数据库搜索策略（Spectronaut directDIA+和DIA-NN MBR）以及载体蛋白质组对鉴定数量的影响，并通过entrapment数据库策略验证了假发现率。

图 1　Fig. 1。图1展示了Chip-Tip工作流程的示意图，以及不同nDIA方法（2Th3ms、4Th6ms、8Th12ms、16Th24ms）在单细胞、10、20和40个HeLa细胞中鉴定的蛋白质和肽段数量。4Th6ms方法在单细胞中鉴定中位数5204个蛋白质，肽段数达41700个。蛋白质序列覆盖率随细胞数量增加而提高，单细胞中位数为12.9%，20细胞为25%。

核心亮点

亮点 1｜单细胞鉴定超5000蛋白质

使用4Th6ms的nDIA方法，在单个HeLa细胞中鉴定到中位数5204个蛋白质，最高超过6000个；肽段中位数达41700个，蛋白质序列覆盖率中位数为12.9%。在20个细胞中鉴定超过7000个蛋白质，肽段数达98054个，覆盖率25%。iBAQ定量显示动态范围跨越几个数量级，且不同细胞数量间iBAQ值呈近线性关系。该方法覆盖所有亚细胞定位，包括超过200个质膜蛋白。

图 2　Fig. 2。图2比较了DIA-NN和Spectronaut在不同搜索策略下的蛋白质鉴定数。使用MBR或directDIA+结合载体蛋白质组可显著增加单细胞鉴定数。在Spectronaut中，随着单细胞文件数增加，鉴定数上升；加入载体蛋白质组后从约4000增至5000。不同搜索策略鉴定的蛋白质丰度分布显示载体蛋白质组有助于检测低丰度蛋白。两个单细胞样本的蛋白质定量相关性在Spectronaut中R=0.91，DIA-NN中R=0.89。

亮点 2｜载体蛋白质组提升鉴定深度

在LFQ-SCP中，使用Spectronaut的directDIA+或DIA-NN的MBR功能，结合高上样量样本（如20个细胞）作为载体蛋白质组，可显著增加单细胞样本的鉴定数量。在Spectronaut中，随着单细胞文件数量增加，鉴定数从约4000升至5000；加入载体蛋白质组后进一步提升。载体蛋白质组有助于鉴定低丰度蛋白质。通过entrapment数据库策略估计，Spectronaut的蛋白质水平经验FDR约3%，DIA-NN约1%。

图 3　Fig. 3。图3展示了Evosep One LC上40SPD、80SPD和120SPD Whisper Zoom方法的单细胞蛋白质鉴定数，以及空白样品的鉴定数。80SPD和120SPD方法在单细胞中鉴定超过4500个蛋白质，空白样品鉴定极少。代表性MS2总离子流图显示不同方法下信号强度。使用Vanquish Neo LC与FAIMS Pro Duo接口，在-48V补偿电压下，单细胞鉴定超过6500个蛋白质，空白样品无污染。

亮点 3｜高通量LC方法实现每日120样本

通过Evosep One LC的Whisper Zoom方法，将通量从40SPD提升至80SPD和120SPD，同时保持高灵敏度，在单个HeLa细胞中鉴定超过4500个蛋白质。80SPD和120SPD使用5cm色谱柱，40SPD使用15cm柱，性能略有差异。空白样品（无细胞）鉴定极少蛋白质，表明工作流程污染低。此外，使用Vanquish Neo LC与FAIMS Pro Duo接口，在-48V补偿电压下，单个HeLa细胞鉴定超过6500个蛋白质。

图 4　Fig. 4。图4展示了单细胞中磷酸化和糖基化的直接检测结果。激酶组树显示168个激酶的定量，CDK1和MAPK1丰度最高。磷酸化位点鉴定数：单细胞中120个pSer、28个pThr、13个pTyr。序列logo显示SP基序富集。磷酸酪氨酸特征离子XIC显示整个LC洗脱范围内信号强。糖基转移酶和糖链氧鎓离子（HexNAc、NeuAc、Hex-HexNAc）的XIC表明糖基化广泛存在。

亮点 4｜无需富集直接检测翻译后修饰

利用高肽段覆盖率，在单细胞中直接鉴定磷酸化和糖基化修饰，无需特异性富集。定量了168个蛋白激酶，覆盖所有主要激酶家族。在单细胞中鉴定到中位数120个磷酸丝氨酸、28个磷酸苏氨酸和13个磷酸酪氨酸位点，位点定位概率高。序列logo分析显示脯氨酸导向的SP基序富集，与CDK等激酶活性一致。通过磷酸酪氨酸特征离子（m/z 216.042）和糖链氧鎓离子（如HexNAc、NeuAc、Hex-HexNAc）的提取离子流图，证实了单细胞中磷酸化和糖基化的广泛存在。

图 5　Fig. 5。图5展示了5-FU处理球体的形态变化和单细胞蛋白质组分析结果。处理球体随时间解体，细胞脱落增加。5-FU代谢途径中TYMP上调，NME1下调。GO富集分析显示环化酶细胞质活性和核糖嘌呤合成等过程受影响。UpSet图展示受影响的GO术语及其调控趋势。

亮点 5｜5-FU处理球体单细胞蛋白质组分析

应用Chip-Tip工作流程分析5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的结直肠癌球体。使用新开发的球体解离缓冲液，在20分钟内有效解离球体。单细胞分析鉴定超过2500个蛋白质。5-FU激活途径中TYMP蛋白上调，NME1下调，与药物代谢和激活相关。GO富集分析显示环化酶细胞质活性和核糖嘌呤合成等过程受影响，与5-FU干扰rRNA合成和核苷酸代谢的机制一致。

亮点 6｜hiPSC分化轨迹的单细胞蛋白质组解析

对未定向分化的hiPSC和拟胚体（EB）细胞进行单细胞蛋白质组分析。在hiPSC中定量到4700个蛋白质，EB细胞中高达6200个。PCA显示hiPSC与EB细胞明显分离，且EB细胞间异质性大。在hiPSC中一致检测到低丰度干细胞标志物OCT4和SOX2，在EB细胞中检测到GATA4（内胚层）、HAND1（中胚层）和MAP2（外胚层）等谱系标志物，表达具有高度变异性。聚类分析揭示六个细胞簇，其中一个仅由hiPSC组成。GO富集显示hiPSC在细胞周期、DNA复制和染色质重塑方面蛋白水平较高，而在有氧呼吸和细胞粘附方面较低，符合干细胞生物学特征。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： cellenONE单细胞分选、proteoCHIP EVO 96芯片、Evosep One LC、nDIA、Orbitrap Astral质谱
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞蛋白质组学、质谱方法开发、干细胞生物学和癌症研究的科研人员。

带走一句

Chip-Tip工作流通过近无损样本制备和nDIA质谱分析，将单细胞蛋白质组深度提升至5000+蛋白质，并实现翻译后修饰的直接检测，为单细胞功能研究提供了强大工具。