IF36.1｜Astral质谱单细胞蛋白质组突破5300蛋白深度

Orbitrap Astral质谱仪将单细胞蛋白质组覆盖提升至5300个蛋白，并实现高精度定量。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

单细胞蛋白质组学（SCP）近年来在样品制备、仪器和数据算法方面取得长足进步，但蛋白组覆盖深度和定量准确性仍是瓶颈。传统方法依赖等压标记多重化以提高灵敏度，而新一代快速质谱仪的出现推动了无标记定量和DIA采集模式的发展。Orbitrap Astral质谱仪结合了Orbitrap和新型Astral分析器，具有高速度、高灵敏度和高动态范围，为超低进样量分析提供了可能。然而，对于单细胞水平的蛋白组覆盖和定量性能，尚缺乏系统的评估和优化。

科学问题

卡在哪里： 此前单细胞蛋白质组学受限于蛋白组覆盖深度和定量准确性，难以在单细胞水平实现高深度、高精度的蛋白质组分析，且缺乏对质谱仪性能的系统评估和优化。

本文要回答： 本文旨在评估Orbitrap Astral质谱仪在超低进样量下的蛋白组覆盖深度、定量准确性和精密度，并应用于单细胞异质性研究。

技术路线

作者主要用了：DIA质谱、FAIMS Pro接口、Aurora Ultimate TS色谱柱、One-Pot样品制备、DirectDIA+分析。

作者首先以250 pg HeLa和K562细胞肽段为模型，优化色谱梯度长度，发现50 SPD（样品/天）时鉴定数最高。随后评估FAIMS Pro接口对信噪比和定量的改善，并利用双蛋白质组混合体系验证定量准确性。最后将优化工作流程应用于A549、H460肺癌细胞和naive hPS细胞及TE-like细胞，结合单细胞分选、One-Pot样品制备和DIA质谱采集，实现单细胞蛋白质组深度覆盖和异质性分析。

图 1　Fig. 1。图1展示了不同梯度长度下250 pg HeLa和K562肽段的蛋白组鉴定数。在50 SPD时鉴定数最高，库搜索显著提升鉴定数。FDR验证显示默认设置可能过于宽松，但优化设置后影响不大。

核心亮点

亮点 1｜50 SPD梯度实现最佳蛋白组覆盖

通过改变色谱梯度长度，作者发现50 SPD（样品/天）时鉴定蛋白组数量最多。在250 pg HeLa细胞肽段中，使用库搜索可鉴定超过7500个蛋白组，K562超过6800个。与无库搜索相比，库搜索使蛋白组鉴定数提高41.5%（HeLa）和31.7%（K562）。此外，匹配重复样本可提高数据完整性至接近100%。

图 2　Fig. 2。图2比较了有无FAIMS Pro接口时的鉴定数和CV。使用FAIMS后，前体和蛋白组鉴定数显著增加，CV降低，信噪比改善，表明FAIMS对低进样量样品有显著优势。

亮点 2｜FAIMS Pro接口显著提升灵敏度和定量精度

使用FAIMS Pro接口后，信噪比明显改善，前体离子鉴定数增加42.6%，蛋白组鉴定数增加55.3%。同时，定量变异系数（CV）显著降低，低丰度蛋白的定量能力增强。尽管部分高丰度肽段丢失，但总体蛋白鉴定数和定量质量均优于无FAIMS的情况。

图 3　Fig. 3。图3通过双蛋白质组混合实验评估定量准确性。Orbitrap Astral质谱仪测得的倍数变化更接近预期值，且CV更低，尤其在低丰度蛋白中优势明显，证明其定量性能优于Exploris 480。

亮点 3｜Astral质谱定量准确性优于Exploris 480

在双蛋白质组混合实验中，Orbitrap Astral质谱仪测得的蛋白丰度倍数变化非常接近预期值，尤其在低丰度酵母蛋白中表现突出。与Orbitrap Exploris 480相比，Astral定量蛋白数量翻倍，且共同鉴定蛋白的CV更低，低丰度蛋白的CV从约20%降至12%。

图 4　Fig. 4。图4展示了A549和H460单细胞蛋白组覆盖和异质性。A549细胞平均鉴定4879个蛋白组，H460为3166个。PCA和UMAP显示细胞按大小和细胞周期聚类，且蛋白组覆盖与细胞大小相关。

亮点 4｜单细胞蛋白组覆盖与细胞大小和周期相关

对66个A549单细胞的分析显示，蛋白组鉴定数随细胞直径增大而增加，平均从1801（小细胞）到2870（大细胞）个蛋白组。使用DirectDIA+匹配后，鉴定数分别提升至3304和4439。最大覆盖达到5300个蛋白。PCA和UMAP分析显示细胞按大小聚类，且与细胞周期标志物（如H4C1、ACTB、NUCKS1）的表达模式相关。

图 5　Fig. 5。图5展示了naive hPS细胞和TE-like细胞的单细胞蛋白质组分析。两种细胞在PCA和UMAP中清晰分离，TE-like细胞上调蛋白富集于上皮分化等通路，且检测到多个已知标志物，证明SCP能区分生物学相关差异。

亮点 5｜单细胞蛋白质组区分hPS和TE-like细胞

对naive hPS细胞和TE-like细胞的分析中，使用库搜索分别鉴定到2544和2339个蛋白组。PCA和UMAP清晰分离两种细胞类型。TE-like细胞上调蛋白富集于细胞骨架组织、上皮细胞分化等通路。此外，检测到GATA2、GATA3等转录因子，以及KRT18、KRT19等TE标志物，与转录组数据一致。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： DIA质谱、FAIMS Pro接口、Aurora Ultimate TS色谱柱、One-Pot样品制备、DirectDIA+分析
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事单细胞蛋白质组学、质谱技术开发及细胞异质性研究的科研人员。

带走一句

Orbitrap Astral质谱仪结合FAIMS和优化梯度，可在单细胞水平实现超过5000个蛋白的深度覆盖和高精度定量，为细胞异质性研究提供了强大工具。