IF58.7｜双AAV碱基编辑高效纠正灵长类视网膜ABCA4突变

双AAV递送split-intein腺嘌呤碱基编辑器，在非人灵长类视网膜实现75%视锥细胞和87%RPE细胞编辑。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

Stargardt病是最常见的单基因黄斑营养不良，由ABCA4双等位基因功能缺失突变引起，其中c.5882G>A（p.Gly1961Glu）突变影响约15%患者。ABCA4蛋白是光感受器和RPE细胞中的脂质翻转酶，其功能缺失导致有毒视黄醇蓄积和细胞死亡。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）可在不产生双链断裂的情况下将A:T转换为G:C，理论上可纠正该突变。然而，此前碱基编辑在人类和非人灵长类神经组织中的高效性尚未得到证实。AAV载体受限于包装容量，需采用split-intein策略将ABE分为两半分别包装。

科学问题

卡在哪里： 已有碱基编辑研究多局限于细胞系或小鼠，在人类和非人灵长类视网膜中缺乏高效基因纠正的证据。此外，ABCA4 p.Gly1961Glu突变相关模型缺乏明显表型，难以评估功能恢复，且AAV载体基因组完整性对编辑效率的影响尚未系统优化。

本文要回答： 开发并优化双AAV递送的split-intein腺嘌呤碱基编辑器，在人类视网膜模型、小鼠和非人灵长类中实现ABCA4 c.5882G>A突变的高效、精确纠正，并评估其临床转化潜力。

技术路线

作者主要用了：双AAV split-intein ABE、视网膜类器官、iPS-RPE、人视网膜/RPE外植体、FACS分选、靶向扩增子测序、ONE-seq。

作者首先在携带ABCA4 c.5882G>A突变的HEK293T细胞系中筛选gRNA和ABE变体，确定ABE8.5m和SpCas9第310位氨基酸分裂位点。随后在人类视网膜类器官、iPS细胞来源RPE、成人视网膜和RPE/脉络膜外植体中优化载体元件，包括intein、NLS、3'UTR和AAV血清型，最终选定AAV5-SABE1。在小鼠模型中验证体内编辑效率后，转向非人灵长类，通过黄斑下注射评估剂量效应和细胞类型特异性编辑。最后通过改进AAV包装质粒（AAV5-v2）和更换衣壳（AAV9-PHP.eB）提高载体基因组完整性，显著提升编辑效率并降低所需剂量。

图 1　Fig. 1。图1展示Stargardt病患者与健康人视网膜的自发荧光和OCT图像，显示患者黄斑中心凹RPE萎缩和光感受器变薄。同时展示双AAV split-intein ABE策略示意图，以及gRNA设计、编辑窗口和A7/A8位点。在HEK293T细胞中筛选split位点和ABE8变体，ABE8.5m表现最佳。

核心亮点

亮点 1｜AAV5血清型高效转导光感受器

在人类视网膜外植体和类器官中筛选8种AAV衣壳，发现AAV5对光感受器的转导效率最高，优于AAV9-PHP.eB。通过FACS分选视锥和视杆细胞，AAV5-SABE1在视锥中达到34%编辑，视杆中25%。在RPE/脉络膜外植体和iPS-RPE中也观察到高编辑率。这确立了AAV5作为后续体内实验的首选载体。

图 2　Fig. 2。图2展示载体元件优化过程。比较Cfa和Npu intein及2×bpNLS与4×bpNLS对编辑效率的影响，发现Cfa+2×bpNLS组合最优。测试不同3'UTR，bGH polyA、trunc SV40 polyA和W3-late SV40 polyA均提高编辑效率。AAV5衣壳在人类视网膜外植体中转导光感受器效率最高，FACS分选显示视锥编辑34%，视杆25%。

亮点 2｜小鼠体内高效编辑靶细胞

在Abca4hu1961E/ms1961G(KO)小鼠中，AAV9-PHP.eB-SABE1视网膜下注射后4周，视网膜gDNA编辑31%，RPE/脉络膜/巩膜gDNA编辑4%，但靶细胞mRNA水平编辑分别达52%和79%。在野生型小鼠中，视网膜和RPE/脉络膜mRNA编辑分别为61%和85%。免疫染色显示79%视网膜细胞和72%RPE细胞同时表达ABE两半。未在眼外组织检测到编辑。

图 3　Fig. 3。图3展示小鼠体内实验结果。实验设计包括AAV9-PHP.eB-SABE1视网膜下注射，2、4、8周取材。免疫荧光显示光感受器和RPE层中ABE(N)和ABE(C)共表达。在Abca4hu1961E/ms1961G(KO)小鼠中，视网膜gDNA编辑31%，mRNA编辑52%；RPE/脉络膜mRNA编辑79%。野生型小鼠中视网膜mRNA编辑61%，RPE/脉络膜85%。

亮点 3｜NHP中剂量依赖性编辑

在食蟹猴中，AAV5-v1-SABE1视网膜下注射后，视网膜gDNA和mRNA编辑呈剂量依赖性，3×10^11 vg/眼时分别为18%和37%，RPE/脉络膜编辑在所有剂量下均较高。FACS分选显示视锥编辑（40%）显著高于视杆（28%）。黄斑中心凹区域编辑较低，可能因取材混入未转导组织。

图 4　Fig. 4。图4展示非人灵长类实验结果。实验设计显示23只眼接受AAV5-SABE视网膜下注射，部分黄斑中心凹脱离。免疫荧光显示ABE(N)在光感受器表达。编辑效率呈剂量依赖性，3×10^11 vg/眼时视网膜gDNA编辑18%，mRNA编辑37%；RPE/脉络膜编辑在各剂量下均较高。FACS分选显示视锥编辑40%，视杆28%。黄斑中心凹区域编辑较低。

亮点 4｜优化AAV包装显著提升编辑效率

通过碱性凝胶电泳和2D-ddPCR发现AAV5-v1-SABE1存在大量部分基因组。改用优化Rep/Cap质粒（AAV5-v2）或AAV9-PHP.eB衣壳后，载体基因组完整性显著改善。在NHP中，AAV5-v2-SABE1在1×10^11 vg/眼剂量下视网膜mRNA编辑达42%，视锥编辑75%，RPE编辑87%；剂量降至4×10^10 vg/眼仍维持46%视锥编辑。AAV9-PHP.eB-SABE1在3×10^11 vg/眼时视网膜mRNA编辑达82%。

图 5　Fig. 5。图5展示AAV包装优化及NHP编辑效率提升。碱性凝胶电泳和2D-ddPCR显示AAV5-v1存在部分基因组，而AAV5-v2和AAV9-PHP.eB基因组完整性改善。在NHP中，AAV5-v2-SABE1在1×10^11 vg/眼时视网膜mRNA编辑42%，视锥75%，RPE87%；剂量降至4×10^10 vg/眼仍维持46%视锥编辑。AAV9-PHP.eB-SABE1在3×10^11 vg/眼时视网膜mRNA编辑82%。

亮点 5｜无脱靶编辑证据

通过Cas-OFFinder预测10,358个潜在脱靶位点，ONE-seq筛选出56个候选位点，结合≤3个错配位点进行靶向深度测序。在治疗的人视网膜和RPE/脉络膜外植体中，未检测到任何显著的A-to-G脱靶编辑，表明ABE8.5m-STGD-gRNA具有高度特异性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 双AAV split-intein ABE、视网膜类器官、iPS-RPE、人视网膜/RPE外植体、FACS分选、靶向扩增子测序、ONE-seq
• 公开数据： PRJNA1170171
• 代码： 公开仓库 https://github.com/genome/bam-readcount；本地已克隆：bam-readcount
• 谁该点开原文： 从事基因编辑、AAV载体开发、视网膜疾病治疗和临床转化研究的科研人员。

带走一句

AAV载体基因组完整性是影响碱基编辑效率的关键变量，优化包装质粒可大幅提升编辑效率并降低剂量，为基因治疗载体设计提供重要参考。