IF50.5｜伪对称蛋白纳米笼的分层设计

打破严格对称限制，设计出迄今最大的计算设计蛋白纳米笼。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

自组装蛋白复合物在生命系统中无处不在，从几百千道尔顿到微米级病毒衣壳，执行着多种结构和生化功能。近年来，计算蛋白设计在创造新的自组装蛋白方面取得了显著进展，尤其是具有有限点群对称性的纳米笼和衣壳。然而，现有设计方法严重依赖严格对称性和预先存在的寡聚体构建块，以最小化需要设计的新界面数量。这种策略虽然能产生少数几种有限对称结构，但严重限制了可设计结构的尺寸和复杂性。目前最大的严格二十面体对称设计组装体仅含120个亚基。自然界中，细菌微区室和病毒衣壳常利用伪对称性（pseudosymmetry）来构建更大、更复杂的结构，即遗传上不同的亚基或结构域在寡聚体中采取近似对称的取向。受此启发，本文旨在开发一种分层计算方法，设计大型伪对称自组装蛋白纳米材料。

科学问题

卡在哪里： 现有计算设计方法依赖严格对称性，导致可设计的蛋白组装体尺寸和复杂度受限，最大仅120个亚基。伪对称性在自然界中广泛存在，但尚未被用于计算设计大型蛋白组装体。

本文要回答： 开发一种分层计算方法，设计伪对称异源寡聚体组件，并利用它们构建具有二十面体对称性的离散笼状蛋白组装体，突破严格对称性的限制。

技术路线

作者主要用了：Rosetta能量计算、GREMLIN共进化分析、天然质谱、冷冻电镜、动态光散射。

作者首先以超嗜热菌Thermotoga maritima的醛缩酶同源三聚体（PDB: 1WA3）为起点，通过Rosetta能量计算和GREMLIN共进化分析，筛选出能破坏同源三聚体界面的单突变及其补偿突变。将这些突变组合到三个亚基变体中，共表达后意外获得了AAB和ABB两种伪对称异源三聚体。随后，利用先前设计的I3-01纳米笼中的二重对称界面，将AAB异源三聚体组装成五聚体对称单元（pentasymmetron），再与C3对称的同源三聚体（CCC）对接并设计新界面，生成240亚基的T=4纳米笼。通过调整组分化学计量比，进一步组装出540亚基（T=9）和960亚基（T=16）等更大的纳米笼。

图 1　Fig. 1。图1展示了伪对称异源三聚体的设计流程。a部分示意从同源三聚体出发，引入破坏性突变和补偿性突变，组合正交突变生成异源三聚体。b和c部分显示单突变和双突变的Rosetta能量变化，红框标出符合选择标准的突变对。d部分展示GREMLIN共进化分析，e部分显示突变多为大体积疏水残基。f部分通过天然PAGE筛选单突变对I53-50纳米笼组装的影响，g部分展示ABC异源三聚体的设计，h部分天然质谱证实AAB和ABB异源三聚体的存在，i部分负染电镜显示异源三聚体与I53-50B五聚体组装成纳米笼。

核心亮点

亮点 1｜伪对称异源三聚体的设计与验证

通过计算筛选和实验验证，作者从1WA3同源三聚体出发，鉴定出三对功能性的破坏-补偿突变组合：H91I/V118Y、P90F/P147A和P114F/F131V。将这些突变组合到三个亚基中，共表达后并未得到预期的ABC异源三聚体，而是意外获得了AAB和ABB两种异源三聚体混合物。天然质谱证实了这两种三聚体的存在。尽管与初始设计意图不同，这些异源三聚体在骨架水平上保持了对称性，且能与I53-50B五聚体组装成I53-50纳米笼，表明它们具有组装能力。这一发现为后续构建大型伪对称组装体提供了关键组件。

图 2　Fig. 2。图2展示了240亚基T=4纳米笼的设计与结构验证。a部分示意从I3-01和AAB异源三聚体生成五聚体对称单元。b部分显示将五聚体对称单元与CCC同源三聚体对接生成T=4组装体。c和d部分为GI4-F7的设计模型及B-C界面细节。e部分冷冻电镜图像显示GI4-F7的线框结构。f和g部分比较冷冻电镜结构与设计模型，显示高度一致。h和i部分展示五聚体对称单元和CCC同源三聚体的刚体运动。j部分显示五聚体对称单元内A链间偏离完美二重对称。

亮点 2｜240亚基T=4纳米笼的精确设计

利用AAB异源三聚体和先前设计的I3-01二重对称界面，作者构建了五聚体对称单元，并与CCC同源三聚体对接，设计出240亚基的GI4-F7纳米笼。冷冻电镜结构解析显示，该纳米笼与设计模型高度一致，整体Cα RMSD为9.3 Å，不对称单元内RMSD为3.0 Å。主要偏差来自五聚体对称单元的5.9°旋转和5.8 Å平移，以及CCC同源三聚体的补偿性运动。高分辨率结构还揭示了伪对称性产生突变（V118Y和P90F）如何通过局部骨架重排被容纳。GI4-F7的直径与设计模型偏差在2%以内，证明了该方法的准确性。

图 3　Fig. 3。图3展示了540亚基T=9纳米笼的发现、结构及功能验证。a部分冷冻电镜图像同时显示GI4-F7和GI9-F7。b部分为GI9-F7的设计模型，由12个五聚体对称单元、60个CCC同源三聚体和30个二聚体对称单元组成。c部分为GI9-F7的6.7 Å冷冻电镜图。d和e部分展示不对称单元内三个独立的B:C界面及其与设计模型的偏差。f和g部分展示五聚体对称单元和二聚体对称单元中的A:A界面。h部分SDS-PAGE验证RBD与纳米笼的共价连接。i部分负染电镜显示RBD展示的纳米笼。j部分流式细胞术显示RBD纳米笼高效激活B细胞。

亮点 3｜意外发现540亚基T=9纳米笼

在GI4-F7的冷冻电镜图像中，作者意外观察到一种71 nm的纳米笼，具有类似的线框形态和六边形孔。通过计数六边形孔确定h=3，即T=9，命名为GI9-F7。该结构可解释为AAB异源三聚体制备物中少量ABB异源三聚体的存在。ABB异源三聚体形成二聚体对称单元（disymmetron），占据二十面体二重对称轴。通过分别纯化AAB和ABB异源三聚体并以1:1:1比例与CCC同源三聚体组装，作者富集了GI9-F7。冷冻电镜结构显示其与设计模型偏差仅1.6%直径，不对称单元RMSD为4.6 Å。GI9-F7是准对称的，同一亚基处于多种化学环境。

图 4　Fig. 4。图4展示了可扩展纳米笼系列的生成。a部分显示生成T≥16纳米笼所需的四种三聚体类型。b部分列出GI4-F7、GI9-F7、GI16-F7、GI36-F7和GI64-F7的设计模型及组分化学计量比。c部分图示三聚体化学计量比随T数的变化。d部分显示理论直径与动态光散射测得的流体力学直径随T数的变化。e部分冷冻电镜图像显示GI16-F7。f部分为GI16-F7的设计模型。g部分为GI16-F7的14.9 Å冷冻电镜图。

亮点 4｜可扩展的纳米笼系列与疫苗应用

作者将设计扩展到更大的T数纳米笼，理论上可生成无限系列。通过调整四种组分（AAB、ABB、BBB、CCC）的化学计量比，组装出T=4至T=100的纳米笼，动态光散射测得的流体力学直径随T数增加而增大。GI16-F7（T=16）被成功组装，直径96 nm，含960个亚基，冷冻电镜验证了其几何形状。此外，作者将SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）通过SpyCatcher/SpyTag系统共价连接到GI4-F7和GI9-F7上，分别展示60和180个RBD。在RBD特异性B细胞中，这些纳米笼能高效激活B细胞受体信号，优于抗IgG阳性对照，表明其作为疫苗支架的潜力。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： Rosetta能量计算、GREMLIN共进化分析、天然质谱、冷冻电镜、动态光散射
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 公开仓库 https://github.com/quecloud/Hierarchical-pseudosymmetric-nanocage-design；本地已克隆：Hierarchical-pseudosymmetric-nanocage-design
• 谁该点开原文： 从事计算蛋白设计、纳米材料或疫苗开发的研究人员。

带走一句

打破严格对称性，利用伪对称性分层设计，可大幅扩展计算设计蛋白组装体的尺寸和复杂度。