IF50.5｜患者来源类器官快速筛选个性化ASO

3周建iPS细胞，6周内完成ASO临床前评价，为罕见病个性化治疗提速。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

反义寡核苷酸（ASO）是短合成核酸分子，通过序列互补结合靶mRNA，调控RNA加工或蛋白表达。已有十余种ASO药物获批，且个性化ASO在Batten病等罕见病中取得积极疗效。然而，ASO的临床前评价通常依赖耗时6-8年的动物模型，而30%的罕见病患儿寿命不足5年，时间窗口极窄。诱导多能干细胞（iPS）及类器官技术为疾病建模提供了新途径，但传统iPS建系方法耗时、昂贵、效率低，限制了其在个性化治疗中的应用。

科学问题

卡在哪里： 现有iPS细胞重编程方案要么依赖昂贵的病毒载体，要么效率低下且需要大量起始细胞，难以规模化。同时，缺乏在患者来源类器官中快速评价ASO疗效的标准化平台，导致个性化ASO的临床前开发周期过长，无法匹配罕见病患者的紧迫需求。

本文要回答： 建立快速、稳健、可规模化的患者来源iPS细胞及类器官平台，并验证其用于个性化ASO临床前评价的可行性。

技术路线

作者主要用了：iPS重编程、心脏类器官、ASO递送、免疫荧光、钙成像、流式、RNA-seq。

作者优化了iPS重编程方案，从冻存PBMC出发，使用episomal质粒电转，并添加小分子混合物（CHIR99021、PD0325901、SB431542、Y-27632等）提高效率，2-3周内建系。随后将iPS分化为心脏类器官，通过TransIT-TKO转染ASO，利用免疫荧光、Western blot、钙成像、流式和靶向RNA-seq评估ASO对基因表达和功能的恢复效果。

图 1　Fig. 1。图1展示iPS重编程流程及多能性验证。a为流程图，b显示患者iPS细胞表达多能性标志物，c为正常核型，d-f分别显示三胚层分化、拟胚体形成和骨骼肌分化，g显示心脏和脑类器官。整体证明该方案快速可靠。

核心亮点

亮点 1｜93%成功率建近300株iPS

在6个月内，利用优化的重编程方案从患者PBMC生成近300株iPS细胞系，成功率超过93%。当起始PBMC数量≥300,000时，成功率达100%。该方案无需特殊设备或昂贵试剂，可在标准实验室实施。iPS细胞表达多能性标志物，核型正常，并能分化为三胚层及多种类器官。

图 2　Fig. 2。图2展示ASO在心脏类器官中的敲低效果。a为靶向TNNT2的ASO设计，b和c显示靶向AUG或剪接位点的ASO显著降低TNNT2蛋白，而对照无影响。d和e显示靶向ASO处理类器官钙瞬变消失，收缩功能丧失。

亮点 2｜ASO在类器官中高效敲低基因

以心脏肌钙蛋白T（TNNT2）为靶标，设计靶向AUG起始位点、剪接供体和剪接受体的2'-O-甲基ASO。转染心脏类器官后，靶向AUG的ASO显著降低TNNT2蛋白表达，而乱序和错配对照无影响。靶向剪接位点的ASO同样降低蛋白表达。钙成像显示，对照ASO处理类器官保持节律性钙瞬变，而靶向ASO处理类器官钙瞬变消失，超过90%的类器官丧失收缩功能。

图 3　Fig. 3。图3展示现有ASO药物在DMD患者类器官中的疗效。a为设计策略，b和c验证DMD基因缺失，d-f显示ASO恢复dystrophin表达，g和h显示转染效率和RNA水平外显子跳跃，i-k显示ASO恢复钙瞬变节律且无毒性。

亮点 3｜现有ASO药物恢复DMD患者类器官功能

从携带DMD基因46-53号外显子缺失的患者（patient 1）建立iPS细胞并分化为心脏类器官。该类器官缺乏dystrophin蛋白，钙瞬变弱且不规律。转染与FDA批准的外显子45跳跃ASO序列一致的2'-O-甲基RNA后，dystrophin表达恢复至健康水平，钙瞬变节律恢复，且效果持续21天。靶向RNA-seq显示约15%的转录本发生外显子45跳跃，流式显示约40%细胞摄取ASO。

图 4　Fig. 4。图4展示个性化ASO在DMD患者类器官中的疗效。a为设计策略，b验证内含子变异，c-e显示个性化ASO恢复dystrophin表达，f为RT-PCR验证剪接恢复，g和h显示钙瞬变恢复且持续，i和j显示转染效率和细胞活力。

亮点 4｜个性化ASO纠正深部内含子突变

针对一对DMD兄弟（patient 2a/2b）携带的深部内含子单核苷酸变异（产生新剪接受体，导致隐蔽外显子掺入和提前终止），设计两条靶向该变异的个性化ASO。在患者来源心脏类器官中，两种ASO均恢复dystrophin蛋白表达至健康水平，RT-PCR证实正确剪接恢复，钙瞬变节律恢复正常。效果持续21天，且无细胞毒性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： iPS重编程、心脏类器官、ASO递送、免疫荧光、钙成像、流式、RNA-seq
• 公开数据： PRJNA1177506
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事罕见病研究、iPS/类器官建模、ASO药物开发或个性化医疗的生信与实验人员。

带走一句

患者来源类器官结合ASO递送，可在6周内完成个性化ASO的临床前评价，为罕见病治疗提供快速、可扩展的筛选平台。