IF50.5｜原位解析TRiC工作循环及PDCD5作为开放态辅因子

冷冻电子断层扫描揭示细胞内TRiC近乎满载折叠新生蛋白，PDCD5特异性结合开放态。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

TRiC是真核细胞中约10%蛋白质折叠所必需的分子伴侣，由两个八聚体环组成，每个环含8个不同亚基（CCT1-CCT8）。在体外，TRiC利用ATP在开放和关闭构象间循环，开放态结合未折叠底物，关闭态包裹底物进行折叠。已有研究鉴定了prefoldin（PFD）和PhLP2A等辅伴侣，但TRiC在细胞内的真实构象分布、底物占用情况以及空间组织仍不清楚。此前体外结构分析多使用ATP-AlFx驱动关闭，无法反映生理ATP循环下的状态。此外，TRiC与新生多肽链的共翻译折叠虽有生化证据，但缺乏原位可视化。

科学问题

卡在哪里： 此前TRiC的结构和功能研究主要基于体外纯化系统，使用非生理的ATP类似物诱导关闭，无法回答细胞内TRiC的开放/关闭比例、底物是否饱和、是否存在空间组织以及辅因子如何参与循环。原位结构分析缺失，导致TRiC在真实细胞环境中的工作模型不明确。

本文要回答： 利用冷冻电子断层扫描解析人细胞内TRiC的构象状态、底物结合和空间分布，重建其原位工作循环，并鉴定开放态特异性辅因子。

技术路线

作者主要用了：cryo-ET、亚断层平均、模板匹配、AlphaFold-Multimer、co-IP、热蛋白质组。

作者首先对约700个HEK293细胞的冷冻电子断层扫描数据进行模板匹配和亚断层平均，解析出TRiC的开放和关闭两种构象，分辨率达10 Å。随后对开放态和关闭态分别进行聚焦分类，区分底物结合和PFD结合状态。通过比较原位结构与体外结构，发现开放态存在额外密度，结合质谱数据和AlphaFold-Multimer预测，鉴定该密度为PDCD5。进一步利用co-IP和突变体实验验证PDCD5与TRiC的相互作用及关键残基。最后分析TRiC在细胞内的空间分布，并用翻译抑制剂HHT处理细胞，观察底物结合和簇形成的变化。

图 1　Fig. 1。图1展示细胞内TRiC的开放和关闭构象的冷冻电镜密度图，以及通过亚断层分类得到的开放态（含PFD结合状态）和关闭态（含不同底物位置）的类别。开放态和关闭态均显示底物密度，表明TRiC在细胞内几乎满载。

核心亮点

亮点 1｜开放与关闭TRiC比例均衡

在未扰动的人细胞内，45.3%的TRiC处于对称开放构象，54.7%处于对称关闭构象，未观察到一开一闭的不对称状态。开放态和关闭态均几乎全部结合底物，表明TRiC在活跃翻译的细胞中接近满载运转。这一发现与体外使用ATP-AlFx诱导关闭的结果不同，提示生理条件下TRiC的构象平衡。

图 2　Fig. 2。图2展示AlphaFold-Multimer预测的PDCD5-CCT3-CCT1-CCT4复合物模型与开放态TRiC密度图的拟合，以及PDCD5与CCT1 stem-loop的相互作用界面。co-IP实验证实PDCD5与TRiC结合，突变体分析显示Ile93和Leu96对结合至关重要。

亮点 2｜PDCD5特异性结合开放态TRiC

原位开放态TRiC在CCT1、CCT3和CCT4附近存在额外密度，通过质谱数据和AlphaFold-Multimer预测鉴定为PDCD5。PDCD5通过其α3和α5螺旋与CCT1的stem-loop相互作用，关键残基Ile93和Leu96介导疏水作用，Arg55、Lys63、Lys66和Lys97介导静电作用。co-IP和突变体实验证实PDCD5与TRiC结合，且该结合在ATP-AlFx诱导关闭后消失。PDCD5与PFD可同时结合开放态，且不阻碍底物进入。

图 3　Fig. 3。图3展示一个代表性断层扫描图中关闭态和开放态TRiC的空间分布，以及关闭态TRiC形成的不同簇形态（线性、环状）。关闭态TRiC倾向于形成簇，而开放态随机分布。

亮点 3｜关闭态TRiC形成簇状结构

空间分析显示，约30%的关闭态TRiC形成含两个或更多颗粒的簇，呈线性或环状排列，而开放态TRiC随机分布。簇的形成与翻译活性相关，HHT处理抑制翻译后，关闭态TRiC簇的比例降至约19%，且簇长度缩短。簇不依赖于多聚核糖体或特定细胞器，提示可能由底物桥接或未知关闭态特异互作因子介导。

图 4　Fig. 4。图4展示HHT处理细胞中TRiC的状态分布和簇形成情况。与未处理细胞相比，翻译抑制后关闭态TRiC簇的比例和长度均减少，但开放态和关闭态的比例基本不变。

亮点 4｜翻译抑制减少底物结合但不改变状态分布

HHT处理抑制翻译后，开放态和关闭态TRiC的比例基本不变，但所有状态中的底物密度均减少，尤其是无PFD结合的开放态TRiC几乎不含底物。这表明TRiC的底物主要来源于新生蛋白，而TRiC的构象循环本身不依赖于翻译活性。同时，TRiC在核糖体出口隧道侧的富集在翻译抑制后消失。

图 5　Fig. 5。图5为提出的TRiC在细胞内的工作循环模型：底物由PFD或直接进入开放态TRiC，ATP水解驱动关闭，PDCD5解离，底物折叠后TRiC重新开放并释放底物，PDCD5再次结合启动新循环。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： cryo-ET、亚断层平均、模板匹配、AlphaFold-Multimer、co-IP、热蛋白质组
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 公开仓库 https://github.com/turonova/cryoCAT；本地已克隆：cryoCAT
• 谁该点开原文： 从事分子伴侣、蛋白质折叠、冷冻电镜或原位结构生物学研究的科研人员。

带走一句

原位结构分析能揭示分子机器在真实细胞环境中的状态分布和空间组织，结合AlphaFold预测和生化验证可高效鉴定新的互作因子。