IF50.5｜适时抑制TGFβ信号诱导脊索形成

单细胞图谱指导的体外模型首次高效生成人类脊索，并揭示YAP与TGFβ时序调控机制。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

脊椎动物体轴形成依赖于胚胎后部祖细胞的协同分化。节点（node）作为中线结构，分泌信号组织周围组织，并最终产生脊索和底板。脊索是脊索动物的标志性结构，为胚胎提供机械和信号支持。WNT、BMP、NODAL和FGF等信号通路参与此过程，但如何精确调控细胞类型产生和组织尚不清楚。现有体外模型如类原肠胚、体节样结构等能产生神经、内胚层和中胚层组织，但普遍缺乏脊索及其依赖的组织如底板，提示脊索特化需要特殊的信号条件。

科学问题

卡在哪里： 现有体外模型无法产生脊索细胞，导致依赖脊索信号的组织（如底板）缺失，限制了人类躯干发育模型的完整性。脊索特化的具体信号需求未被满足，且YAP信号在躯干形成中的作用尚不明确。

本文要回答： 利用单细胞转录组学绘制鸡胚躯干祖细胞图谱，并据此优化人类多能干细胞分化条件，建立包含脊索的三维躯干发育模型，解析脊索形成的信号调控机制。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、RNA荧光原位杂交、微图案培养、3D类器官、免疫荧光、电镜。

作者首先对鸡胚4-13体节期尾部组织进行scRNA-seq，鉴定出神经中胚层祖细胞（NMP）和脊索祖细胞（NotoP）等关键群体，并通过HCR原位杂交定位其空间分布。基于此图谱，在人类胚胎干细胞微图案培养中模拟节点信号环境，通过调节BMP/NODAL抑制时机，发现延迟24小时抑制可高效诱导脊索样细胞。进一步将该条件应用于3D聚集体，结合视黄酸前体培养，形成具有脊索、神经管和体节样组织的“notoroid”模型。

图 1　Fig. 1。图1展示鸡胚单细胞图谱：UMAP显示27,379个细胞，按阶段着色，标记基因区分PXM、LPM、神经、脊索等群体。重点：NMP（SOX2+TBXT+）和NotoP（NOTO+CHRD+FOXA2+）被鉴定，且NotoP表达BMP抑制剂CHRD和SPRY2，缺乏LEFTY1。

核心亮点

亮点 1｜鸡胚单细胞图谱揭示脊索祖细胞

对鸡胚4S-13S尾部组织进行scRNA-seq，鉴定出NMP（SOX2+TBXT+）和NotoP（NOTO+CHRD+FOXA2+）等群体。NotoP位于节点背侧，表达BMP抑制剂CHRD和SPRY2，缺乏NODAL抑制剂LEFTY1。空间映射显示NEFM标记NMP，CNTN2标记前神经细胞，NOTO与CNTN2在节点附近形成背腹分离域。该图谱为后续体外模型提供了分子标志物和空间参考。

图 2　Fig. 2。图2通过HCR原位杂交定位关键群体：NEFM标记NMP于节点-原条边界背侧，CNTN2标记前神经细胞于吻侧，NOTO与CNTN2在节点附近背腹分离。CHRD+SPRY2+细胞位于节点背侧，与FOXA2共表达。空间图谱总结于图2j。

亮点 2｜YAP失活促进WNT和TBXT表达

在微图案培养中，pERK1/2环和TBXT表达依赖FGF信号，且WNT激动剂协同维持。YAP激活（TRULI处理或表达YAP(S5A)-GFP）抑制TBXT表达，并降低WNT靶基因LEF1水平，表明核YAP抑制WNT信号。在鸡胚中，TBXT表达区域与活性YAP下调一致。因此，YAP失活与FGF/MAPK信号协同促进WNT通路激活和TBXT诱导。

图 3　Fig. 3。图3展示微图案培养的posterior neuruloid：SOX2hi中心，TBXThi边缘，TBX6+细胞在外周聚集。pERK1/2环和TBXT表达依赖FGF，YAP激活抑制TBXT和LEF1。表明YAP失活促进WNT和TBXT表达。

亮点 3｜延迟TGFβ抑制诱导脊索命运

在微图案培养中，持续抑制BMP/NODAL产生少量脊索样细胞（<2%），而延迟24小时抑制使TBXT+FOXA2+细胞比例增至44±8%，且表达NOTO、SHH、CHRD等脊索标志物。延迟48小时则主要产生内胚层和侧板中胚层。时序基因表达分析显示WNT/FGF先诱导NODAL，随后CHRD表达，NOTO短暂上调后下降。这表明存在一个短暂窗口，期间NODAL/BMP信号允许脊索特化，而持续抑制维持NMP。

图 4　Fig. 4。图4比较不同BMP/NODAL抑制时机：持续抑制产生少量脊索样细胞；延迟24小时显著增加TBXT+FOXA2+脊索样细胞（44±8%）；延迟48小时产生内胚层和侧板中胚层。scRNA-seq确认细胞类型，时序基因表达显示NODAL先于CHRD和NOTO。

亮点 4｜3D notoroid模型包含功能性脊索

将延迟24小时TGFβ抑制方案应用于3D聚集体，并添加视黄酸前体，形成伸长的notoroid。约70-75%的notoroid具有TBXT+脊索样条纹，周围为SOX2+神经上皮。scRNA-seq确认脊索细胞表达NOTO、CHRD、SHH等，并存在底板和腹侧神经祖细胞。脊索细胞与底板细胞空间距离显著小于与背侧神经细胞的距离，提示脊索分泌SHH诱导腹侧模式。TNE报告基因验证脊索身份，电镜显示脊索细胞具有鞘膜、糖原和脂滴等特征。

图 5　Fig. 5。图5展示3D notoroid模型：延迟TGFβ抑制后形成伸长结构，内部TBXT+脊索样条纹，周围SOX2+神经上皮。scRNA-seq显示脊索、底板、运动神经元等细胞类型。TNE报告基因验证脊索身份，电镜显示脊索细胞具有鞘膜和特征性细胞器。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、RNA荧光原位杂交、微图案培养、3D类器官、免疫荧光、电镜
• 公开数据： GSE223189、GSE224404
• 代码： 公开仓库 https://github.com/facebookresearch/detectron2、https://github.com/tiagu/Nucleus、https://github.com/tiagu/gastrunet；本地已克隆：trunk_dev_scRNAseq、gastrunet、Nucleus、detectron2
• 谁该点开原文： 从事发育生物学、干细胞分化、类器官构建及单细胞数据分析的研究者。

带走一句

单细胞图谱指导的体外模型设计，通过精确调控信号时序，成功生成此前缺失的脊索组织，为解析发育机制和构建复杂类器官提供了新范式。