IF31.7｜汇聚型启动子：基因调控的新维度

汇聚转录不是干扰，而是协同调控，约四分之一活跃启动子参与其中。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

增强子和启动子协同调控基因表达是发育和疾病中的基本过程。过去十年发现，活跃的增强子和启动子都能启动双向转录，包括双向启动子产生两条mRNA、启动子上游反义RNA（uaRNA/PROMPT）以及增强子RNA（eRNA）。最近发现启动子下游的反义转录（daRNA）出乎意料地普遍，形成由四个相邻转录起始位点（TSS1-4）组成的复杂结构：TSS1产生uaRNA，TSS2产生宿主RNA，TSS3产生daRNA，TSS4产生下游正义RNA。其中宿主RNA和daRNA是汇聚转录的。这类成对启动子被称为汇聚型启动子。传统观点认为汇聚转录会导致转录干扰，即两个RNA聚合酶II碰撞或相互干扰，从而抑制基因表达。但此前研究对daRNA与宿主RNA表达相关性的结论并不一致，有负相关、无相关等报道，提示汇聚转录的调控关系可能超越简单的抑制或激活模型。

科学问题

卡在哪里： 此前对汇聚型启动子的研究大多基于单一细胞状态下的静态数据，缺乏动态转录系统的分析。因此，汇聚型启动子是否具有不同于其他启动子的功能特征，以及汇聚转录在基因调控中扮演何种角色，仍不清楚。

本文要回答： 本文旨在利用动态转录系统，揭示汇聚型启动子的功能特征，并阐明汇聚转录在基因调控中的作用。

技术路线

作者主要用了：CAGE-seq、RNA-seq、GRO-seq、ATAC-seq、smFISH、CRISPR/Cas9、荧光素酶报告基因。

作者利用MDM2抑制剂Nutlin-3a激活p53信号通路，在三种细胞系（MCF-7、U2OS、RPE-1）中构建动态转录系统。通过CAGE-seq精确定位转录起始位点（TSS），结合RNA-seq和GRO-seq分析转录动态。首先识别汇聚型启动子（由两对双向启动子组成，产生汇聚转录），然后分析其表达相关性、染色质特征、转录因子结合模式，并通过smFISH、报告基因实验和CRISPR/Cas9基因编辑验证汇聚启动子的协同调控功能。

图 1　Fig. 1。图1展示了汇聚型启动子的结构模式图和表达动态。e-g显示发散TSS对（TSS1-TSS2和TSS3-TSS4）以及汇聚TSS对（TSS2-TSS3）在Nutlin-3a处理下的log2FC相关性。发散TSS对呈正相关，而汇聚TSS对也呈显著正相关，挑战了转录干扰模型。h和i显示正相关不受宿主RNA表达水平和TSS间距离影响。

核心亮点

亮点 1｜汇聚启动子转录正相关

在Nutlin-3a处理下，汇聚型启动子中两个汇聚的TSS（TSS2和TSS3）的表达变化呈显著正相关，与双向启动子中发散TSS的相关性相当。这种正相关不受宿主RNA表达水平或两个启动子间距离的影响。通过GRO-seq分析新生RNA，进一步证实了汇聚转录的正相关。smFISH实验显示，在同一基因座、同一细胞中，FAS和ACTA2两个汇聚基因可以同时转录，24%的细胞中观察到重叠信号，直接证明汇聚转录可以在同一基因座发生而不降低启动子活性。

图 2　Fig. 2。图2a显示GRO-seq数据中汇聚启动子区域正义链和反义链的差异表达呈正相关。b为FAS/ACTA2基因座的UCSC浏览器截图，显示p53 ChIP-seq峰和p53RE位于ACTA2启动子附近，CAGE-seq和RNA-seq数据显示FAS和ACTA2在Nutlin-3a处理后上调。c为smFISH图像，显示同一细胞中FAS和ACTA2的转录信号重叠，证明汇聚共转录。

亮点 2｜转录因子协同调控汇聚启动子

对p53、E2F4和RFX7三种转录因子的分析显示，无论转录因子结合在上游还是下游启动子，汇聚型启动子的两个组成启动子都表现出同向调控。例如，p53结合的汇聚启动子主要上调两个启动子；E2F4/DREAM结合的汇聚启动子主要下调两个启动子；RFX7结合的汇聚启动子上调两个启动子。在PIK3IP1/PIK3IP1-DT位点，RFX7结合在下游反义启动子，敲低RFX7消除了Nutlin-3a介导的两个基因的上调。报告基因实验和CRISPR/Cas9突变p53RE进一步证实，下游启动子介导p53响应并正向影响上游启动子。

图 3　Fig. 3。图3展示转录因子结合汇聚启动子的热图。a-c分别显示p53、E2F4和RFX7结合的汇聚启动子，无论转录因子结合在上游还是下游启动子，两个组成启动子的log2FC都呈同向变化。d为PIK3IP1/PIK3IP1-DT基因座，显示RFX7结合在下游启动子，敲低RFX7消除了两个基因的上调。

亮点 3｜汇聚启动子具有独特染色质特征

ATAC-seq显示汇聚启动子的两个组成启动子区域均为开放的染色质，中间有核小体占据。汇聚启动子区域高度重叠CpG岛，并富集H3K4me3、H3K9ac、H3K27ac和H2AFZ等活性启动子标记，但缺乏增强子标记H3K4me1。差异ATAC-seq分析显示，Nutlin-3a处理后两个组成启动子的染色质可及性变化呈正相关，支持协同调控。

图 4　Fig. 4。图4a显示双荧光素酶报告基因实验，BAX、PTP4A1和CCNG1的汇聚启动子区域在Nutlin-3a处理后驱动荧光素酶表达上调，删除下游启动子（含p53RE）后上调消失，删除上游启动子仅降低基础活性。b显示GADD45A基因报告系统，删除第三内含子中的下游启动子后，Nutlin-3a介导的激活被消除。c显示CRISPR/Cas9突变FAS和PTP4A1下游启动子中的p53RE后，宿主基因和下游反义转录本表达均降低。

亮点 4｜汇聚启动子占活跃启动子四分之一

通过更灵敏的检测方法，作者识别出约4800-6800个汇聚型启动子，占所有GENCODE注释TSS重叠的CAGE-seq峰的24.5-29.2%。汇聚启动子TSS的表达水平显著高于普通启动子TSS，且具有更宽的H3K4me3、H3K27ac和Pol II信号，以及更宽的G-四链体信号。此外，汇聚启动子TSS富集R-loop形成，提示其可能具有功能重要性。

图 5　Fig. 5。图5展示汇聚启动子的表观遗传特征。a显示ATAC-seq信号在两个组成启动子区域呈双峰，中间有核小体占据。b-g显示CpG岛、H3K4me3、H3K9ac、H2AFZ、H3K27ac和H3K4me1的信号分布，其中活性启动子标记在TSS2和TSS3之间富集，而增强子标记H3K4me1在汇聚启动子区域缺失。h显示差异ATAC-seq信号在两个组成启动子间呈正相关。

亮点 5｜注释2158个宿主基因的daRNA

作者结合CAGE-seq、RNA-seq和QuantSeq数据，注释了来自2158个宿主基因的daRNA，其中1635个在GENCODE中缺失。daRNA中位长度为9568 bp，97%的daRNA延伸穿过宿主TSS而没有明显的Pol II阻断。这些daRNA与许多已注释的lncRNA和蛋白质编码基因重叠，表明现有注释不完整。在雌二醇处理的MCF-7细胞中，daRNA和宿主RNA的表达也呈正相关，提示汇聚启动子的协同调控具有普遍性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： CAGE-seq、RNA-seq、GRO-seq、ATAC-seq、smFISH、CRISPR/Cas9、荧光素酶报告基因
• 公开数据： GSE53499、GSE162299
• 代码： 公开仓库 https://github.com/BioinfGuru/tispec、https://github.com/tbischler/PEAKachu；本地已克隆：tispec、PEAKachu
• 谁该点开原文： 研究转录调控、启动子功能或非编码RNA的生信与实验人员。

带走一句

分析启动子时，别只盯着基因上游，下游几百bp内的反义启动子可能协同调控同一个基因，应纳入cis-regulatory区域考虑。