IF31.7｜SPRINTER揭示肿瘤克隆增殖异质性及演化动态

SPRINTER算法利用单细胞全基因组测序，首次在克隆水平解析肿瘤增殖异质性及其与转移播散的关系。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

增殖是癌症的核心标志之一，与多种肿瘤的不良预后相关。传统增殖评估依赖于Ki-67染色或bulk RNA测序，只能获得肿瘤整体水平的增殖分数，无法区分同一肿瘤内不同基因型克隆的增殖差异。单细胞全基因组DNA测序（scDNA-seq）技术如DLP+，既能通过拷贝数变异（CNA）推断克隆结构，又能利用复制过程中早期和晚期复制区域读段深度波动识别S期细胞，为克隆级增殖分析提供了可能。然而，S期细胞的CNA推断受复制波动干扰，且现有方法假设细胞群体同质，无法处理实体瘤中常见的克隆异质性，导致S期细胞识别和克隆归属困难。

科学问题

卡在哪里： 此前缺乏正式方法将S期细胞准确分配到对应克隆，且现有S期识别方法灵敏度有限，尤其对早期S期和混合倍性样本效果差。此外，克隆级增殖异质性及其与转移播散、ctDNA释放、基因组变异率的关系尚未被系统研究。

本文要回答： 开发SPRINTER算法，实现单细胞DNA测序数据中S/G2期细胞的准确识别与克隆分配，并应用于肺癌、乳腺癌和卵巢癌数据集，探究克隆增殖异质性的演化规律及临床意义。

技术路线

作者主要用了：单细胞全基因组测序、拷贝数变异推断、复制时序分析、系统发育重建、ctDNA分析。

SPRINTER算法分六步：首先利用参考复制时序将基因组bin分为早期/晚期复制区域，并计算读段深度比（RDR）；然后进行复制感知的拷贝数分割，仅保留同时包含早期和晚期bin的片段作为候选CNA；接着通过统计置换检验独立识别每个细胞的S期状态；随后基于G0/G1/G2期细胞推断克隆；再将S期细胞以最大后验概率分配给克隆；最后通过总读段数识别G2期细胞。作者利用EdU标记的HCT116二倍体和四倍体细胞系构建了高精度基准数据集，验证了SPRINTER在S期识别和克隆分配上的优越性，并应用于NSCLC原发-转移配对样本及乳腺癌/卵巢癌数据集。

图 1　Fig. 1。图1展示了SPRINTER算法的六个主要步骤。第一步计算每个基因组bin的RDR和复制时序（早期为品红色，晚期为绿色）。第二步通过分别在早期和晚期bin中识别候选断点，仅保留两者支持的断点（红色虚线保留，灰色虚线丢弃），推断可能受相同CNA影响的相邻bin片段。第三步通过统计置换检验识别S期细胞。后续步骤包括克隆推断、S期细胞分配和G2期识别。该图概括了SPRINTER如何利用复制时序信息克服S期细胞CNA推断的难题。

核心亮点

亮点 1｜SPRINTER算法准确识别S期细胞并分配克隆

在EdU标记的HCT116二倍体和四倍体细胞系基准数据上，SPRINTER在S期识别上优于CCC、MAPD和rtMAPD，在中晚期S期识别上提升10-90%，且保持高精度。在混合倍性数据中，SPRINTER的细胞特异性检验仍表现稳健，而MAPD等方法失效。SPRINTER对S期细胞的克隆分配准确率达98%，远超基于相关性的启发式方法（62-69%）。此外，SPRINTER能准确识别G2期细胞（>80%精确率和召回率），并在模拟数据中证明增加的S期细胞数量对于区分小克隆间的增殖差异至关重要。

图 2　Fig. 2。图2评估了SPRINTER在基准数据集上的性能。a部分显示在二倍体和四倍体数据中，SPRINTER（绿色）在识别G1/G2和S期细胞方面优于CCC（蓝色）、MAPD（橙色）和rtMAPD（红色），尤其在中晚期S期提升显著。b部分ROC曲线表明SPRINTER在区分G1期和活跃复制细胞方面具有最佳分类性能。c和d部分显示SPRINTER识别更多S期细胞有助于区分小克隆间的增殖差异。e和f部分显示SPRINTER的克隆分配准确率远高于基于相关性的方法。

亮点 2｜NSCLC原发与转移灶存在克隆增殖异质性

对患者CRUKP9145的10个样本（5个原发灶、5个转移灶）共14,994个细胞进行DLP+测序，SPRINTER识别出52个克隆。几乎所有样本内均存在S分数显著不同的克隆，且原发灶和转移灶间也存在差异。例如，原发区域2、3、4、8的bulk S分数估计无差异（22%），但内部存在多个增殖差异克隆；右枕叶转移灶bulk S分数（13%）仅为右肾上腺（31%）的一半，但两者均含有相似S分数的克隆。Ki-67染色、细胞核成像和临床影像均验证了SPRINTER结果的可靠性。

图 3　Fig. 3。图3展示了NSCLC患者CRUKP9145中原发和转移样本的克隆增殖异质性。a部分显示各样本中克隆S分数的分布，红色星号表示样本内克隆间存在显著差异。原发区域2、3、4、8的bulk S分数相似，但内部克隆异质性明显；右枕叶和右肾上腺的bulk S分数差异大，但均含有相似S分数的克隆。b部分显示Ki-67染色与SPRINTER估计一致。c部分显示SPRINTER预测的S期细胞核直径显著大于非S期细胞。d部分显示SPRINTER识别的克隆与bulk测序的SNV和CNA高度一致。

亮点 3｜高增殖克隆具有更高的转移播散潜力

通过整合SNV和CNA重建系统发育树，并利用MACHINA推断转移播散模式，发现三个主要转移分支中，第三分支包含大多数高增殖克隆，且是唯一包含额外播散克隆的分支（从左肾上腺转移灶播散至右肾上腺和左额叶）。以克隆与最近播散克隆的遗传距离作为播散潜力的代理，发现S分数与遗传距离呈显著负相关（基于SNV和CNA距离均如此），表明基因组上与播散克隆更相似的克隆增殖更快，提示高增殖克隆更可能成为转移的种子。

图 4　Fig. 4。图4展示了患者CRUKP9145的肿瘤系统发育和克隆增殖与转移播散的关系。a部分显示基于SNV和CNA重建的系统发育树，克隆按样本着色。b部分显示同一棵树按S分数着色，显示第三分支包含大多数高增殖克隆。c部分显示推断的转移播散模式，第三分支包含从左肾上腺到右肾上腺和左额叶的播散。d部分显示克隆特异性ART事件，如KRAS的晚期到早期ART主要出现在第三分支。e部分显示S分数与播散遗传距离呈负相关。f部分显示ctDNA释放指数与S分数正相关。

亮点 4｜增殖克隆的ctDNA释放增加

利用同一患者的ctDNA测序数据，计算每个克隆的ctDNA释放指数（ctDNA频率与原发灶频率之差），发现该指数与SPRINTER估计的S分数显著正相关。第三转移分支的克隆携带的SNV在多个时间点的ctDNA中具有高频率，与SPRINTER推断的高增殖一致。这表明在同一肿瘤内，增殖更快的克隆向血液中释放更多ctDNA，提示ctDNA丰度不仅反映克隆体积，也受克隆增殖影响。

图 5　Fig. 5。图5展示了SPRINTER在TNBC和HGSC数据集上的应用。a部分显示各肿瘤中克隆S分数的分布，多数肿瘤存在增殖异质性。b-d部分显示高增殖克隆的细胞中SNV、SV和CNA的单细胞率显著高于低增殖克隆。e部分显示高增殖克隆富集CDK4、EGFR等癌基因扩增。f部分显示基因集富集分析结果，PI3K/AKT/mTOR和KRAS信号等通路在高增殖克隆中上调。

亮点 5｜高增殖克隆富集增殖相关基因扩增

在7例TNBC和15例HGSC共61,914个细胞的数据集上，SPRINTER识别出280个克隆。高增殖克隆（S分数高于中位数）的细胞中，克隆特异性SNV、SV和CNA的单细胞率均显著高于低增殖克隆。此外，高增殖克隆显著富集CDK4、EGFR等癌基因扩增，基因集富集分析显示PI3K/AKT/mTOR信号和KRAS信号上调等增殖相关通路富集。HRD克隆的G2/S比值显著高于其他克隆，提示HRD克隆的G2期相对延长。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 单细胞全基因组测序、拷贝数变异推断、复制时序分析、系统发育重建、ctDNA分析
• 公开数据： PRJNA1158752、PRJNA770772
• 代码： 公开仓库 https://github.com/zaccaria-lab/sprinter；本地已克隆：sprinter
• 谁该点开原文： 从事单细胞基因组学、肿瘤演化、液体活检或增殖异质性研究的科研人员。

带走一句

SPRINTER为单细胞DNA测序数据提供了克隆级增殖分析框架，使研究者能够将增殖表型与基因型演化结合，揭示转移播散和ctDNA释放的克隆特异性机制。