IF36.1｜基因级单细胞轨迹对齐框架 Genes2Genes

新框架 Genes2Genes 可在单基因水平对齐单细胞轨迹，精准捕捉匹配与错配。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

单细胞转录组技术能够同时观测数千个基因，从而描述细胞状态的动态变化，例如分化、发育或对扰动的响应。为了比较不同条件下的动态过程（如对照与药物处理、体外分化与体内发育），研究者通常先推断伪时间轨迹，然后采用动态规划算法（如动态时间规整 DTW）进行轨迹对齐。现有方法如 CellAlign 和 TrAGEDy 虽然被广泛使用，但存在明显局限：DTW 假设每个参考时间点至少匹配一个查询时间点，无法识别插入或缺失（indels）导致的错配，且距离度量仅考虑均值差异而非分布差异。这些限制使得现有方法难以准确捕捉轨迹间的分歧与收敛模式，也无法在基因水平上解析异质性。

科学问题

卡在哪里： 现有轨迹对齐方法（如 CellAlign、TrAGEDy）基于 DTW，其核心假设是参考与查询轨迹间存在一一对应关系，无法识别错配（插入/缺失），且距离度量仅基于均值差异，忽略了基因表达分布的方差信息。此外，这些方法产生单一的整体对齐，掩盖了不同基因可能具有的不同对齐模式，无法在单基因水平上解析轨迹差异。

本文要回答： 本文旨在开发一个能在单基因水平对齐单细胞轨迹的新框架，能够同时捕获匹配和错配，并支持下游分析如聚类和通路富集。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、动态规划、贝叶斯信息论、MML距离、层次聚类。

作者开发了 Genes2Genes (G2G) 框架，其核心是一个扩展了 Gotoh 算法的动态规划模型，该模型整合了 DTW 和 gap 建模，定义了五种对齐状态（M、V、W、I、D）。G2G 首先对参考和查询的基因表达轨迹进行分布插值，然后使用基于最小消息长度（MML）准则的贝叶斯信息论距离度量来评估时间点之间的匹配代价，并通过一个五状态机模型来分配状态转移代价。最终，G2G 为每个基因生成一个五状态字符串，这些字符串可用于聚类分析、聚合对齐和通路富集等下游分析。

图 1　Fig. 1。图1展示了单细胞轨迹对齐的概念和五种对齐状态。a 部分示意参考和查询轨迹的匹配与错配如何支持下游分析；b 部分定义了五种状态（M、V、W、I、D）及其理论来源，其中 DTW 仅包含 M、V、W，而 G2G 扩展了 gap 建模。c 部分通过成本矩阵和路径示例说明 DP 如何生成对齐；d 部分展示了一个基因的五状态对齐字符串，直观呈现匹配和错配的时序模式。

核心亮点

亮点 1｜G2G 在模拟数据上优于现有方法

在包含七种对齐模式（匹配、早期/中期/晚期分歧、早期/中期/晚期收敛）的模拟数据集上，G2G 的基因级对齐准确率高达 98.2%–100%，显著优于 TrAGEDy 的两种变体（TrAGEDyMINIMUM 和 TrAGEDyNULL），后者准确率在 5.4%–100% 之间波动且变异较大。CellAlign 无法描述分歧和收敛模式。此外，G2G 的层次聚类能以 0.1% 的误聚类率分离七种模式，远低于 CellAlign 的 k-means 聚类（误聚类率 42.6%–60.4%）。在无共享过程的阴性对照数据上，G2G 正确生成 100% 错配的聚合对齐，而 TrAGEDy 错误推断出匹配片段。

图 2　Fig. 2。图2概述了 G2G 框架的工作流程。输入为参考和查询的 log1p 标准化表达矩阵及伪时间估计。G2G 首先对每个基因轨迹进行分布插值，然后运行扩展的 Gotoh DP 算法，该算法使用基于 MML 的距离度量和五状态机模型。生成的基因对齐字符串被聚类，并用于计算聚合对齐和下游分析。图中还展示了 MML 距离计算的示意图和五状态机的转移概率。

亮点 2｜G2G 在真实数据中揭示基因级错配

在 PAM 与 LPS 刺激的树突状细胞时间序列数据上，G2G 不仅重现了 CellAlign 发现的 PAM 刺激后基因表达的滞后，还识别出早期和晚期伪时间点的错配。例如，在早期，LPS 刺激的细胞中 IRF7、STAT2 和 IFIT1 等基因出现“早熟表达”，而 PAM 刺激的细胞表达仍低；在晚期，LPS 刺激的基因表达达到峰值后下降，而 PAM 刺激的细胞仍在上升。聚类分析揭示了不同基因簇的特异性对齐模式，并识别出 SGMS2 为最相似基因，CCRL2 和 C5AR1 为高度不相似基因，其中 TNF 尽管 log fold change 不显著，但轨迹对齐显示其高度不相似，凸显了轨迹对齐在检测差异表达基因方面的优势。

图 3　Fig. 3。图3比较了 CellAlign、TrAGEDy 和 G2G 的算法差异及在模拟数据上的表现。a 部分说明 CellAlign 仅使用 DTW 且状态空间为 [M, W, V]，而 TrAGEDy 和 G2G 均包含 gap 建模，但 G2G 统一了 DTW 和 gap 建模。b 部分展示三种方法在模拟轨迹上的对齐结果，G2G 能准确识别匹配和错配区域。c-e 部分显示 G2G 在七种模拟模式上的基因级对齐准确率高于 TrAGEDy，且聚类效果更好。f 部分展示 G2G 的层次聚类能清晰分离七种模式。g 部分显示 CellAlign 和 TrAGEDy 的聚类噪声更大。h 部分展示在无共享过程的阴性对照数据上，G2G 生成 100% 错配，而 TrAGEDy 错误推断出匹配。

亮点 3｜G2G 发现 IPF 中早期/晚期差异

在健康肺与特发性肺纤维化（IPF）肺的 AT2 细胞分化轨迹比较中，G2G 的聚合对齐显示仅在晚期伪时间点出现错配，这与健康肺分化为 AT1 细胞而 IPF 分化为异常基底样细胞（ABCs）的已知生物学一致。对错配基因（对齐相似度≤40%）进行通路富集分析，发现上皮间充质转化（EMT）是最显著富集的通路。进一步聚类揭示了一些基因在早期/中期就出现错配，如 NNMT、CXCL1 和 CXCL8，这些可能成为阻止病理性 ABC 分化的潜在治疗靶点。

图 4　Fig. 4。图4展示了 G2G 在 PAM 与 LPS 刺激的树突状细胞时间序列数据上的对齐结果。a 部分为实验设计示意图。b 部分显示 99 个核心抗病毒基因的聚合对齐，顶部堆叠条形图显示参考和查询的细胞组成，底部矩阵显示时间点间的匹配基因计数。c 部分展示 IRF7、STAT2 和 IFIT1 等基因的个体对齐，显示早期错配。d 部分展示峰值炎症模块基因的聚合对齐和聚类结果。e 部分展示不同簇的代表基因对齐。f 部分展示对齐相似度统计，识别出 SGMS2 为最相似基因，CCRL2 和 C5AR1 为高度不相似基因。

亮点 4｜G2G 揭示体外 T 细胞发育的 TNF 信号缺失

在人工胸腺类器官（ATO）体外分化 T 细胞与体内胎儿参考 T 细胞发育轨迹的比较中，G2G 对齐显示早期和晚期存在错配。早期错配归因于体外起始于 iPS 细胞而体内起始于造血干细胞，晚期错配则与 TNF 信号通路相关。通路富集分析发现 TNF 信号通过 NF-κB 通路是最显著富集的错配基因集，其中 FOSB、JUNB 和 NR4A2 等转录因子在体内成熟 T 细胞中表达上调，但在体外缺失。实验验证表明，在 ATO 培养的最后一周添加 TNF 可降低体外 SP T 细胞与体内 1 型固有 T 细胞之间的基因表达距离，并上调 IL7R 等成熟标志物，表明 TNF 信号是优化体外 T 细胞成熟的重要靶点。

图 5　Fig. 5。图5展示了 G2G 在健康与 IPF 肺 AT2 细胞分化轨迹上的对齐结果。a 部分为实验设计示意图。b 部分显示所有高变基因的聚合对齐，显示晚期错配。c 部分展示 ABC 特异性标志基因的对齐，显示分歧模式。d 部分展示 EMT 通路富集结果。e 部分展示 CAMK1D 等基因的个体对齐，显示几乎完全错配。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、动态规划、贝叶斯信息论、MML距离、层次聚类
• 公开数据： GSE136831、E-MTAB-12720
• 代码： 公开仓库 https://github.com/Teichlab/G2G_notebooks、https://github.com/Teichlab/Genes2Genes；本地已克隆：Genes2Genes
• 谁该点开原文： 从事单细胞轨迹分析、发育生物学、疾病机制研究或体外分化优化的科研人员。

带走一句

G2G 提供了一种在单基因水平上对齐单细胞轨迹的新方法，能够揭示现有方法无法检测的错配和异质性，为疾病机制研究和体外分化优化提供了有力工具。