IF50.5｜实时追踪转录-翻译偶联的动态机制

细菌中RNA聚合酶与核糖体可远距离物理偶联，核糖体无需碰撞即可激活暂停的RNA聚合酶。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

在细菌中，转录和翻译发生在同一细胞区室，RNA聚合酶（RNAP）和核糖体可以物理和功能偶联。高分辨率的核糖体-RNAP复合物结构（称为表达体）提供了偶联过程的初步机制见解，但这些结构只是动态过程的静态快照。已有结构大致分为碰撞态、偶联态和非偶联态。碰撞态在体内正常生长条件下未被检测到，仅在用转录抑制剂假尿苷霉素处理细胞时才能分离到，这引发了关于碰撞是否是在体内重新激活暂停RNAP的主要机制的疑问。偶联态与已知的转录和翻译功能方面以及NusA-NusG桥接兼容，可能代表一个功能性状态。然而，冷冻电镜结构无法直接监测活性，也无法回答物理偶联是否仅在两个机器在mRNA序列上接近时发生，还是也可以通过mRNA成环发生。

科学问题

卡在哪里： 此前研究主要依赖静态结构，缺乏对转录-翻译偶联动态过程的直接观察。尚不清楚核糖体与RNAP能否在mRNA间隔较长时通过mRNA成环维持物理偶联，以及这种远距离偶联是否具有功能，例如激活暂停的RNAP。

本文要回答： 本文旨在实时追踪转录延伸、翻译延伸以及核糖体与RNAP之间的物理和功能偶联，揭示偶联的动态机制。

技术路线

作者主要用了：体外重构、多色单分子荧光显微镜、FRET、ALEX、HMM。

作者在体外重构了完整且有活性的转录-翻译系统，并开发了多色单分子荧光显微镜实验，同时跟踪同一mRNA分子上的转录延伸和翻译延伸。通过标记核糖体和RNAP上的荧光染料，利用FRET信号实时监测两者的物理偶联状态。实验设计包括：构建停滞的转录延伸复合物（TEC），加载核糖体形成翻译前起始复合物，然后加入NTP和翻译延伸因子启动两个过程。通过改变mRNA间隔长度、添加Nus因子、模拟碰撞等条件，系统研究了偶联的动态变化和功能后果。

图 1　Fig. 1。图1展示了实验设计和单分子检测原理。a部分显示制备转录-翻译复合物的流程，包括无C序列和CCC序列的设计。b部分展示单分子检测方案，同时跟踪同一mRNA上的转录和翻译，并显示翻译延伸周期中tRNA在A、P、E位点的构象变化。c部分展示代表性单分子轨迹，显示转录（黄色）和翻译（红色和绿色）的荧光强度变化，表明可以同时监测两个过程。

核心亮点

亮点 1｜核糖体碰撞RNAP时减速

通过比较无阻碍翻译和碰撞条件下的翻译延伸动力学，发现当核糖体与停滞的RNAP碰撞时，核糖体在非旋转和旋转状态的停留时间逐渐增加，表明核糖体减速。在碰撞条件下，停留时间不再符合单指数动力学，提示存在额外的限速步骤。增加aa-tRNA和EF-G浓度十倍并不能显著影响核糖体减速，表明减速不是由于空间位阻影响底物递送，而是由于在碰撞态进行翻译循环所需的机械力增加。此外，碰撞条件下核糖体更倾向于停留在旋转状态（50±2% vs 17±5%），与体内假尿苷霉素停滞的表达体观察一致。

图 2　Fig. 2。图2比较了核糖体在无阻碍延伸和碰撞条件下的翻译动力学。a部分显示实验设计，包括46 nt间隔的停滞复合物。b和c部分分别展示延伸和碰撞条件下的代表性平滑轨迹。d部分显示碰撞条件下翻译氨基酸数量的概率密度直方图，大多数核糖体完成4-6个翻译循环。e部分显示非旋转和旋转状态停留时间的箱线图，碰撞条件下停留时间显著增加，表明核糖体减速。

亮点 2｜mRNA间隔长度影响偶联效率

通过单分子FRET实验，作者测量了不同mRNA间隔长度（46-457 nt）下核糖体与RNAP的偶联状态。发现随着间隔长度增加，FRET效率分布逐渐向低值移动，偶联比例从mRNA-46的65±4%下降到mRNA-457的8±1%。对于mRNA-46，所有分子保持偶联直至光漂白，偶联寿命中位数至少150±5秒。对于更长的间隔，大多数表达体也保持偶联直至光漂白，但少数分子表现出解偶联和重新偶联，重新偶联时间随间隔长度增加而变慢（mRNA-85为10.1±1.4秒，mRNA-193为24.3±5秒）。这些结果表明核糖体和RNAP可以通过mRNA成环在远距离上物理相互作用。

图 3　Fig. 3。图3展示了mRNA间隔长度对偶联的影响。a部分显示DNA模板设计。b部分显示偶联表达体中标记位点的位置。c部分显示偶联状态比例随mRNA间隔长度增加而下降。d和e部分分别展示偶联和非偶联表达体的示意图和代表性轨迹。f部分显示不同mRNA长度下的FRET分布直方图，随着间隔增加，FRET效率向低值移动。g部分显示NusG和NusA对mRNA-85偶联态FRET效率的影响，NusG增加紧凑度，NusA导致松散。

亮点 3｜NusG促进表达体紧凑和偶联

在mRNA-85间隔下，添加NusG（无论是否添加NusA）导致偶联态的FRET效率增加，表明表达体更加紧凑。相反，单独添加NusA导致表达体结构松散。在转录延伸过程中，NusG的存在使转录结束时保持偶联的分子比例增加约两倍，在同时存在NusA和NusG时达到约80%。而NusG(NTD)和NusG(F165A)突变体（只能与RNAP相互作用）不能增加功能偶联，但保留提高转录速率的能力。这些结果表明NusG是维持表达体稳定和偶联的主要驱动因素。

图 4　Fig. 4。图4展示了转录延伸过程中偶联的动态变化。a部分显示从偶联态开始转录的实验设置和示例轨迹，以及表达体结构中30S-Cy3和DNA-Cy3.5之间的距离。b部分显示从碰撞态开始转录的实验设置和示例轨迹。c部分显示从偶联态或碰撞态开始转录时所有分子的偶联停留时间蜂群图，碰撞后的偶联寿命显著缩短。d和e部分显示转录结束时保持偶联的分子比例，碰撞后比例大幅下降。f部分显示Nus因子对从偶联态开始转录的偶联效率的影响。

亮点 4｜碰撞降低后续偶联效率

从碰撞态开始转录延伸时，核糖体与RNAP之间的FRET信号在转录开始后出现，表明两者从碰撞态转变为偶联态。然而，与无碰撞的偶联态相比，碰撞后的偶联寿命缩短十倍以上，仅为7.8±0.8秒，且分子在转录过程中多次动态偶联和解偶联。转录结束时保持偶联的分子比例从无碰撞的41.4±0.5%降至4.9±1.5%，在添加NusG或NusA+NusG后分别增加到14±3%和36±1%。作者推测碰撞后偶联的短暂性可能归因于碰撞后核糖体-RNAP界面的结构或组成变化，例如RNAP丢失omega亚基。

图 5　Fig. 5。图5展示了核糖体对NusA暂停RNAP的激活作用。a和b部分显示单分子实验设置，分别针对无核糖体（-70S）和有核糖体（+70S）的停滞TEC或表达体。c部分显示不同条件下单分子转录时间的概率密度分布叠加图，在NusA存在时，有核糖体的转录时间显著缩短。d部分显示NusA在hisPEC结合冷冻电镜结构中的构象，以及表达体中NusA与30S亚基的潜在冲突。e部分显示体外转录分析中核糖体对暂停逃逸寿命的影响，在第二个暂停位点效果更显著。

亮点 5｜核糖体远距离激活NusA暂停的RNAP

通过单分子转录实验和体外转录分析，作者发现当RNAP被NusA暂停时，存在偶联核糖体（间隔46 nt）可使转录时间缩短约两倍（205.5±0.5秒 vs 100.6±10.3秒）。在体外转录分析中，核糖体在第二个暂停位点（间隔106 nt）将暂停逃逸寿命降低2.2倍（182±9秒 vs 84±17秒），而在第一个暂停位点（间隔71 nt）效果较弱（1.1倍）。添加在反式（trans）中组装的核糖体不能激活转录，表明需要共享mRNA。结构叠加显示，在偶联表达体中，NusA不能采用促进暂停的构象，因为会与30S亚基冲突。这些结果表明，远距离偶联的核糖体可以通过阻止NusA采用暂停促进构象来激活暂停的RNAP。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 体外重构、多色单分子荧光显微镜、FRET、ALEX、HMM
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事细菌基因表达调控、单分子生物物理或转录翻译偶联研究的科研人员。

带走一句

转录-翻译偶联并非仅靠紧密跟随的核糖体碰撞，远距离mRNA成环介导的物理偶联同样重要，这为分析细菌基因表达调控提供了新维度。