IF36.1｜Spapros：面向靶向空间转录组的最优探针集选择

一个端到端管线，同时优化细胞类型识别和细胞状态变异捕获，并考虑探针设计约束。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

靶向空间转录组技术通过测量预定义基因集，在单细胞和亚细胞分辨率下捕获组织中的细胞类型和状态拓扑。基因集的选择对捕获组织中的空间信号至关重要，需要选择信息量最大且最小的基因集进行检测，并确保能设计出探针。当前的选择通常依赖标记基因，这阻碍了检测连续空间信号或新状态。单细胞转录组学已使组织异质性研究达到前所未有的规模和分辨率，空间转录组技术进一步增加了空间背景。然而，靶向空间方法测量基因数量有限，因此选择哪些基因至关重要。基因集选择必须由分析目标和技术限制指导，包括细胞类型识别、细胞状态描述、细胞通讯模式表征，同时需考虑表达水平限制和探针设计约束，并允许纳入先验知识。

科学问题

卡在哪里： 现有基因集选择方法要么只优化细胞类型分类，要么只优化转录变异捕获，很少同时考虑两者，且没有方法在选基因时纳入探针设计的技术约束。此外，大多数方法是基于评分的非组合方法，只是手动选择的辅助工具，未能将基因选择和探针设计作为整体组合优化。

本文要回答： 开发一个端到端的探针集选择管线，在考虑先验知识、技术约束和探针设计的同时，同时优化细胞类型识别和转录变异捕获，并验证其在空间数据中的表现。

技术路线

作者主要用了：scRNA-seq、空间转录组、MERFISH、SCRINSHOT、PCA、差异表达、决策树、组合优化。

作者首先构建了12个评估指标，量化基因集在细胞类型识别、变异恢复、基因冗余、技术约束违反和计算时间上的表现，并验证这些指标与空间信号的相关性。然后，基于经典特征选择方法的基准结果，设计了Spapros管线：先进行探针设计过滤，排除无法设计探针的基因；再用PCA选择高变异基因，训练决策树进行细胞类型分类，迭代添加差异表达基因以提升分类性能；最后结合表达约束惩罚，输出最优基因集和探针序列。

图 1　Fig. 1。图1展示了探针集选择问题的示意图：从scRNA-seq数据中选择基因集用于靶向空间转录组，需优化细胞类型识别和细胞类型外变异捕获。同时展示了探针设计约束：探针必须唯一匹配目标基因的表达异构体，不能与其他基因RNA共享序列。还展示了不同特征选择方法在多个评估指标上的性能比较，PCA和DE方法在不同方面表现突出。

核心亮点

亮点 1｜Spapros在多个指标上优于现有方法

在12个数据集上的基准测试中，Spapros在细胞类型识别和变异恢复的综合得分上显著优于其他10种方法（50和150基因，除n=50时与geneBasis无显著差异）。Spapros是唯一同时优化两个目标的方法，位于Pareto前沿。在细胞类型分类上，SpaprosCTo表现最佳，其次为Spapros和NS-Forest；在变异恢复上，SelfE、SCMER、PCA等方法得分高，但与Spapros无显著差异。此外，Spapros在细胞间通讯（CCI）恢复上与变异恢复高度相关（r=0.85），且能无偏地捕获不同细胞类型间的相互作用。

图 2　Fig. 2。图2展示了Spapros管线的示意图，包括探针设计过滤和基因集选择步骤。UMAP比较显示，Spapros选择的50和150个基因能很好地保留细胞类型结构，与8000个高变基因的参考相似。点图展示了Spapros选择的基因在细胞类型中的表达模式，如CST3、FCER1A和IL1B能区分树突状细胞亚型。

亮点 2｜探针设计约束显著影响基因集性能

除Spapros外，其他方法均未在选基因时考虑探针设计约束，导致大量基因无法设计探针。移除这些基因后，各方法性能显著下降，且需要手动调整，导致非最优设计。Spapros的探针设计管线支持SCRINSHOT、MERFISH、seqFISH+和HybISS等技术，通过图搜索算法生成非重叠探针集，确保探针特异性和热力学性质。在比较中，Spapros优于手动文献标记基因列表和已发表的ISS面板。

图 3　Fig. 3。图3展示了使用Spapros选择的探针集在成人肺组织中进行SCRINSHOT实验的结果。平均表达图显示空间细胞类型与单细胞参考匹配良好。空间分布图展示了细胞类型在肺内的定位。在气管基底细胞中，FOS表达呈现与KRT15和S100A2正交的空间变异，免疫荧光验证了这一发现。

亮点 3｜Spapros在成人肺SCRINSHOT实验中验证

使用Spapros设计的64基因探针面板在健康人肺组织上进行SCRINSHOT实验，成功识别了所有目标细胞类型，且细胞类型空间分布与已知结构一致。在气管基底细胞中，FOS表达呈现与KRT15和S100A2正交的空间变异，免疫荧光验证了这一发现。此外，内皮细胞中IGFBP7和RGCC、巨噬细胞中APOE和IFITM1也显示出细胞类型内的空间变异。这表明Spapros探针能检测超越细胞类型组成的空间表达变异。

图 4　Fig. 4。图4展示了Spapros与其他方法在50基因选择上的性能比较表格，Spapros在多个指标上排名第一。P值热图显示Spapros与其他方法的性能差异显著。Pareto前沿图显示Spapros在细胞类型分类和变异恢复之间取得了最佳平衡。CCI恢复分析显示Spapros与变异恢复高度相关，且能无偏地捕获细胞类型间相互作用。

亮点 4｜跨数据集选择和可扩展性

Spapros在不同肺数据集上的选择性能方差与同一数据集内不同供体间的方差相似，表明跨数据集选择具有稳健性。Spapros的计算时间与其他快速方法相当，且不随基因集大小增加而增加，而是随细胞类型数量线性扩展。内存和时间均线性扩展，可在本地运行。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： scRNA-seq、空间转录组、MERFISH、SCRINSHOT、PCA、差异表达、决策树、组合优化
• 公开数据： GSE132042、GSE115469
• 代码： 公开仓库 https://github.com/AlexSount/SCRINSHOT、https://github.com/HelmholtzAI-Consultants-Munich/oligo-designer-toolsuite、https://github.com/theislab/spapros；本地已克隆：spapros-smk、spapros_reproducibility、SCRINSHOT
• 谁该点开原文： 从事空间转录组实验设计、单细胞数据分析或生物信息学方法开发的研究人员。

带走一句

做靶向空间转录组实验设计时，不要只选标记基因，应使用Spapros这类组合优化工具，同时考虑细胞类型识别、状态变异和探针设计约束，以最大化发现空间模式的机会。