IF50.5｜向真菌植入细菌诱导全新内共生

单细胞注射技术首次在真菌中实现细菌植入，并成功诱导可遗传的内共生。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

内共生是进化创新的重要驱动力，但新内共生的从头起源罕见且难以追溯。已知自然内共生如线粒体、叶绿体及昆虫共生菌，但早期事件仍不清楚。真菌与细菌的内共生研究较少，尤其缺乏可控实验体系。本研究以早期分化真菌 Rhizopus microsporus 和其天然内共生菌 Mycetohabitans rhizoxinica 为模型，该菌在特定宿主株中严格垂直传播，且双方可独立培养，为人工诱导内共生提供了理想基础。

科学问题

卡在哪里： 此前合成内共生研究多集中于昆虫，在真菌中尚无成功建立稳定内共生的报道。真菌细胞壁坚硬、膨压高，细菌植入技术难度大，且新共生对初期适应性代价高，垂直传播不稳定，缺乏有效的实验手段来观察和筛选内共生起始事件。

本文要回答： 利用 FluidFM 单细胞注射技术将细菌植入非宿主真菌，观察内共生起始过程，并通过适应性进化实验探究稳定内共生的条件和遗传基础。

技术路线

作者主要用了：FluidFM、流式分选、蛋白质组、基因组测序、LC-MS/MS。

作者首先改造 FluidFM 探针，使其能穿透真菌细胞壁并注入细菌。以天然宿主株 EH 验证注射后双方存活及垂直传播，再以非宿主株 NH 植入大肠杆菌和 M. rhizoxinica，观察命运差异。随后利用流式分选对含菌孢子进行连续十轮正向选择，监测阳性比例和萌发率，计算适应度指数。通过交叉回接实验和基因组测序解析宿主与共生菌的适应性变化，并检测代谢产物转移。

图 1　Fig. 1。图1展示了FluidFM注射真菌芽管的实验装置和流程。探针尖端被磨成双尖结构，孔径500-1000 nm，可穿透细胞壁并注入细菌。注射后芽管被转移至培养皿中恢复生长，实现单细胞操作和后续观察。此图说明了技术的关键改造和操作步骤。

核心亮点

亮点 1｜FluidFM 实现真菌内细菌植入

作者将 FluidFM 探针尖端磨成双尖结构，结合酶解软化细胞壁，在高达 6.5 bar 压力下成功将约 1-30 个细菌注入 R. microsporus 芽管。注射后真菌和细菌均存活，且天然共生菌 M. rhizoxinica 在宿主株 EH 中能正常运动并垂直传播至孢子。该技术突破了真菌细胞壁和膨压障碍，为实时观察内共生起始提供了可能。

图 2　Fig. 2。图2比较了大肠杆菌和M. rhizoxinica在R. microsporus中的命运。a部分显示大肠杆菌在菌丝内快速增殖并形成局部热点，真菌形成隔膜将其隔离；b部分显示M. rhizoxinica在非宿主中正常增殖和运动，未引发隔膜；c部分流式图显示大肠杆菌未出现在孢子中，而M. rhizoxinica有少量阳性孢子；d和e部分证实阳性孢子含菌并能萌发。

亮点 2｜大肠杆菌引发真菌防御反应

将 GFP 标记的大肠杆菌注入 R. microsporus 后，细菌在胞质中快速增殖并形成局部高密度区域，真菌通过形成隔膜将细菌隔离在分隔的菌丝区段中，未感染区段继续正常生长。最终在孢子中未检测到大肠杆菌（检测限 1/1,000,000），表明大肠杆菌无法垂直传播，内共生在单代内失败。这揭示了未适应细菌会触发宿主免疫防御，导致内共生夭折。

图 3　Fig. 3。图3展示了适应性进化实验的设计和主要结果。a部分为实验流程和种群管理示意图；b部分显示阳性孢子萌发率从6.3%升至75%；c部分显示阳性比例从0.01%升至24.1%；d部分显示适应度指数显著提升；e部分显示阳性孢子萌发延迟现象；f和g部分显示所有进化株系均产生WF-1360F和根瘤菌素。

亮点 3｜M. rhizoxinica 在非宿主中垂直传播

将 M. rhizoxinica 注入非宿主株 NH 后，细菌在菌丝中正常增殖和运动，未引发隔膜形成。流式分选显示约 0.01% 的孢子含有细菌，部分阳性孢子能萌发并维持细菌增殖。这证明 M. rhizoxinica 可扩展宿主范围，实现跨宿主垂直传播，为后续适应性进化实验奠定基础。

图 4　Fig. 4。图4通过交叉回接实验验证适应性来源。a部分显示FEvo–BAnc组合萌发率显著高于祖先组合；b部分流式图显示进化后孢子GFP强度降低；c部分显示GFP强度与细菌载量正相关；d部分显示祖先组合中高细菌载量抑制萌发，而进化组合中细菌载量普遍较低且对萌发影响不显著。

亮点 4｜适应性进化显著提升内共生适应度

通过连续十轮流式分选正向选择，含菌孢子的萌发率从初始的 6.3% 提升至 75%，阳性比例从 0.01% 升至最高 24.1%。适应度指数（萌发率×阳性比例）从 0.0006% 增至最高 25.3%。交叉回接实验表明，进化后的真菌与祖先细菌组合（FEvo–BAnc）萌发率高达 88%，显著高于祖先组合，提示宿主真菌的适应性变化是主要驱动力。

图 5　Fig. 5。图5展示了基因组突变和共生稳定性。a部分显示line 4中四个突变频率随进化上升，与适应度指数增加同步；b部分显示在无选择压力下，进化后共生体比祖先共生体维持更久，阳性孢子稀释速度更慢，验证了适应性进化提高了共生稳定性。

亮点 5｜内共生转移了根瘤菌素合成能力

LC-MS/MS 分析显示，所有进化株系在第 7 轮均产生 WF-1360F 和根瘤菌素（rhizoxin），而对照非宿主株 NH 不产生这些化合物。这表明通过诱导内共生，细菌的代谢功能成功转移至新宿主，且宿主具备修饰 WF-1360F 的能力，并非仅存在于天然共生株中。

亮点 6｜宿主基因组突变驱动共生稳定

全基因组测序发现，进化过程中细菌基因组无突变，而真菌宿主积累了多个突变，尤其在最优株系 line 4 中检测到 4 个高频突变，其频率上升与适应度指数增加同步。这些突变基因可能涉及内吞、转录、翻译等过程。此外，进化后孢子中细菌载量降低，减轻了对萌发的抑制，提高了共生稳定性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： FluidFM、流式分选、蛋白质组、基因组测序、LC-MS/MS
• 公开数据： PRJEB76713
• 代码： 原文未给出公开 GitHub/GitLab 仓库
• 谁该点开原文： 从事合成生物学、微生物组工程或进化生物学研究的科研人员。

带走一句

单细胞注射结合流式分选和适应性进化，为在真菌中工程化构建稳定内共生提供了可复用的实验范式，值得关注宿主适应性突变的筛选策略。